bFGF對氧化應激狀態(tài)下小鼠卵母細胞糖代謝能力的影響

李瑞冬， 方南洙， 金慶國， 柳海星， 李鐘淑

(延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

卵母細胞是哺乳動物特有的生殖細胞，卵母細胞的質(zhì)量決定著母畜的繁殖率以及仔畜的健康以及品質(zhì)的優(yōu)良。為了提高家畜的繁殖率，通常會采用IVM技術以及胚胎移植技術從體外人工提高動物的繁殖率。然而在體外的操作過程中存在著某些因素會影響卵母細胞的質(zhì)量，從而降低試驗的成功率，其中常見的因素就是氧化應激[1]。

氧化應激是一種細胞內(nèi)氧化還原水平不平衡導致的細胞的應激狀態(tài)，其主要誘因ROS會與細胞內(nèi)各種分子結(jié)合反應產(chǎn)生各種有害的自由基，因此氧化應激能夠?qū)е录毎锬ぁ⑦z傳物質(zhì)等的破壞。其次ROS作為一種第2信使也在時刻的對下游的基因表達起著調(diào)節(jié)的作用，如ROS對Keap1-Nrf2-ARE、PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)可以提高細胞的抗氧化、增殖分化以及糖代謝的能力[2]。糖代謝能力的下降將會導致細胞的衰老，進而引發(fā)各方面的疾病[3]。因此，過量的ROS導致細胞內(nèi)細胞通路的異常運作，對細胞活力有著不良的影響。近來也有研究表明，氧化應激還能夠通過干擾胰島素信號通路導致小鼠的糖代謝紊亂，從而對小鼠的健康產(chǎn)生不良影響[4]。

因此，為了對抗這種不良影響，外源性抗氧化物質(zhì)的添加顯的格外重要。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗氧化物質(zhì)有很多，但大多數(shù)都是從植物中提取而來，其含量甚微甚至遠不及內(nèi)源性抗氧化劑，如褪黑素、α-硫辛酸、輔酶Q等。堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)是一種自身能夠合成的細胞蛋白因子，其廣泛存在于人體組織中，其次在快速增殖的組織中，如胚胎[5-6]。bFGF已知的生物學作用主要體現(xiàn)在組織損傷的修復，血管的生成以及創(chuàng)傷的愈合中[7-8]，近些年研究發(fā)現(xiàn)，bFGF還對氧化應激造成的損傷細胞具有一定的保護作用[9-11]。然而有關bFGF在卵母細胞氧化應激方面的研究迄今還是一片空白。

因此，該試驗以6～8周的雌性小白鼠為試驗材料，旨在通過比較正常組(正常培養(yǎng)液)、氧化組(含有250 μmol/L過氧化氫)、抗氧化組(150 ng/L bFGF+250 μmol/L)3組細胞中的氧化應激標志物ROS、MDA、8OHdG水平、細胞內(nèi)還原物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)、線粒體功能如膜電位熒光強度、能荷水平，以及細胞代謝途徑中無氧途徑酶pk，hk，6-pfk的活性以及調(diào)節(jié)無氧途徑與有氧途徑的pdk1酶活性的變化，探究bFGF對氧化應激條件下的小鼠卵母細胞的保護作用以及對細胞糖代謝途徑調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象

雌性昆明小鼠，購自延邊大學實驗動物中心，6～8周周齡，體重25～30 g。在IVC條件下飼養(yǎng)，溫度為26 ℃，固定的光周期暗周期各12 h，自由采食，自由飲水。在飼養(yǎng)適應一周后進行試驗，操作均符合試驗動物福利的相關規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器

血促性素(PMSG，寧波第二激素廠，貨號110254564)，M2培養(yǎng)液(SIGMA，貨號M7167)，M16P培養(yǎng)液(M7292)，礦物油，即用型透明質(zhì)酸酶，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，索萊寶，貨號50037-M07E)，GSH 熒光染色劑(CellTrackerTMBlueCMF2HC Dye，Thermo Fisher Scientific，貨號C12881)，JC-1[CBIC2(3)，碧云天，貨號C2005]。ELISA酶聯(lián)試劑盒(上海遠慕)，實體顯微鏡(Nikon，TMS)，熒光顯微鏡(Nikon，ECLIPSE Tis 634268)，二氧化碳培養(yǎng)箱(ESCO，CCL-170B-8)。

1.1.3 主要試劑的配制

1) bFGF的配制 bFGF的配制按照說明進行配制，將bFGF粉末溶解于70 μL無菌水中，配制成濃度為0.15 mg/mL的原液，后加入M16使其濃度為150 ng/mL。

2) 過氧化氫的配制 過氧化氫的濃度按照相關文獻確定為250 μmol/L[12]，其配置方法為：取10 μL 30%過氧化氫原液，加入990 μL M16形成A液，然后取A 10 μL 溶于990 μL M16中獲得B液，然后取250 μL B液與750 μL M16混合即得250 μmol/L的過氧化氫。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的收集與培養(yǎng)

選取符合試驗標準的健康雌性小鼠，腹腔注射10 IU的PMSG 2 d后脫頸處死，打開腹腔，取出卵巢，剔除脂肪后置于M2液滴中，顯微鏡下用手術刀切碎卵巢并加入透明質(zhì)酸酶，吸取至5 mL微量離心管中，移至培養(yǎng)箱中進行酶消化作用 5 min。取出微量離心管吸取沉淀。用合適的玻璃針拾取卵母細胞。卵母細胞在M2培養(yǎng)液中洗滌3～5次，洗去雜質(zhì)后，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

1.2.2 ROS、MDA、8OHdG的檢測

氧化應激標志物的檢測嚴格按照試劑盒說明書進行。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。

1.2.3 GSH熒光強度檢測

按照試劑說明書配置好CMF2HC工作液后分裝，使用時提前解凍并加入990 μL M16后待用，將培養(yǎng)后的卵母細胞用1 g/L PBS-PVA洗滌3次后置于含有染色劑的小滴中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min，取出用PBS-PVA洗滌3次，洗去染料，置于新的PBS-PVA液滴中并覆蓋礦物油，熒光顯微鏡下進行紫外熒光激發(fā)，得到的熒光染色照片用 Image J 1.49對熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強度相對值表示。

1.2.4 線粒膜電位熒光強度檢測

按照試劑說明書配置好JC-1工作液后分裝，使用時提前解凍并加入990 μL M16后待用，將培養(yǎng)后的卵母細胞用1 g/L PBS-PVA洗滌3次后置于含有染色劑的小滴中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，取出用PBS-PVA洗滌3次，洗去染料，熒光顯微鏡下進行紫外熒光激發(fā)，得到的熒光染色照片用 Image J 1.49對熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強度相對值表示。

1.2.5 卵母細胞活力、能荷以及細胞糖代謝酶活力的檢測

檢測方法同1.2.2。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 bFGF對小鼠卵母細胞的抗氧化標志物水平的影響

由表1可見，與正常組相比，100 μmol/L過氧化氫處理組的卵母細胞內(nèi)總氧化應激標注物含量顯著高于正常組(ROS、MDA、8OHdG，n=90，P<0.05)，與此一致，100 μmol/L過氧化氫處理組的卵母細胞內(nèi)氧化應激標注物含量顯著高于抗氧化處理組(n=90，P< 0.05)，而正常組與抗氧化處理組卵母細胞內(nèi)總ROS含量相比，差異不顯著(P=0.08>0.05)；正常組與抗氧化處理組卵母細胞內(nèi)MDA含量相比，差異顯著(P<0.05)；正常組與抗氧化處理組卵母細胞內(nèi)8OHdG含量相比，差異顯著(P<0.05)。

表1 bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)氧化應激標志物含量影響

2.2 bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)GSH熒光水平的影響

為探究bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)還原當量GSH含量的影響，現(xiàn)采用CMF2HC Dye對卵母細胞進行活細胞染色，每組20個細胞，避光染色后在熒光顯微鏡激發(fā)拍攝后用ImageJ 1.49 對熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強度相對值表示。bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)GSH含量的影響見圖1。

注：(A)不同實驗組卵母細胞內(nèi)谷胱甘肽熒光強度。(B)谷胱甘肽熒光強度量化分析圖，

2.3 bFGF對小鼠卵母細胞活力及能荷水平的影響

細胞內(nèi)ATP、ADP、AMP的動態(tài)比是衡量細胞活力的一種指標，其中，能荷的換算更能體現(xiàn)出細胞活力的情況。結(jié)果顯示：正常組卵母細胞能荷比值接近于0.95，而過氧化氫組能荷接近0.5，顯著低于正常組(P<0.05)，抗氧化組細胞能荷水平大致在0.7左右，顯著高于過氧化氫組(P<0.05)，正常組與抗氧化組相比，差異顯著(P<0.05)，試驗表明bFGF能夠顯著提高氧化應激狀態(tài)下小鼠卵母細胞的能荷水平(表2，圖2)。

表2 bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量及能荷影響

圖2 bFGF處理對氧化應激條件下小鼠 卵母細胞能荷水平量化分析圖

2.4 bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)線粒體膜電位熒光水平的影響

線粒體是細胞內(nèi)能量的中轉(zhuǎn)站，因此細胞的活性應與線粒體的膜電位相關，因此采用JC-1染色劑分別對3組卵母細胞進行染色，處理結(jié)果如圖3，通過數(shù)據(jù)可以看出，正常組膜電位熒光強度顯著高于過氧化氫組(P<0.05)，過氧化氫組膜電位熒光強度顯著低于抗氧化組(P<0.05)。

注：(A)不同處理組內(nèi)細胞線粒體膜電位熒光強度比較，(B)線粒體膜電位熒光強度量化分析圖。

2.5 bFGF對氧化應激條件下小鼠卵母細胞代謝酶活力影響

由圖4數(shù)據(jù)分析可知，hk、6-pfk、pk酶的酶活力均顯著低于H2O2處理組，而pdk1則恰恰相反，抗氧化組4種酶活性均顯著高于H2O2處理組(P<0.05)。然而正常組與抗氧化組相比，pdk1、6-pfk酶活力差異顯著(P<0.05)，而pk、hk酶2組之間無顯著性差異(P>0.05)。表明bFGF的添加有效調(diào)控了糖代謝酶的活性：恢復了氧化應激導致的糖酵解途徑活化，并恢復了細胞正常的有氧代謝途徑(n=90，P<0.05)。

圖4 bFGF對小鼠卵母細胞內(nèi)pdk1、pk、hk、6-pfk活性的影響

3 討論

卵母細胞的質(zhì)量不僅對家畜的繁殖率和動物仔畜的品質(zhì)有很大影響，而且還會影響著畜牧業(yè)未來的發(fā)展。氧化應激作為影響卵母細胞質(zhì)量的主要因素不僅影響著卵母細胞的結(jié)構(gòu)，更加對細胞的功能產(chǎn)生嚴重的影響，其不僅會對線粒體膜造成損傷，還會加速細胞的衰老或死亡。氧化應激標志物作為檢測氧化應激水平指標對于疾病的判斷及預測有很大的作用[13-15]。谷胱甘肽作為一種內(nèi)源性抗氧化劑，能夠防止自由基、過氧化物、脂質(zhì)過氧化物和重金屬等活性氧對重要細胞成分造成的損害[16]。因此，細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的水平通常也用來衡量細胞抵御氧化應激的能力[17-19]。由于氧化應激對細胞的膜結(jié)構(gòu)造成了不可逆的危害，因此對于線粒體的功能也是產(chǎn)生影響的，線粒體功能通常通過細胞內(nèi)對ATP水平和膜電位的測定來體現(xiàn)。周秀芬，姜宏[20]表明，線粒體膜電位與ROS的含量呈負相關，且線粒體膜電位越低精子的活力越低。此外細胞的糖代謝水平也與膜電位有很大關聯(lián)，線粒體膜電位的高低與線粒體的氧化磷酸化能力呈正相關[21]。

細胞的糖代謝即取決于線粒體的功能結(jié)構(gòu)，也取決于其內(nèi)部酶的活力。蔣欣，徐陽表明，卵母細胞的發(fā)育及質(zhì)量與糖代謝酶的調(diào)控息息相關[22]。因此該試驗設計并研究bFGF對氧化應激狀態(tài)下小鼠卵母細胞糖代謝酶活力的影響。

結(jié)果顯示，經(jīng)過bFGF處理的卵母細胞顯著降低了氧化應激，標注物的含量顯著高于正常組(ROS、MDA、8OHdG，n=90，P<0.05)。 bFGF處理后也顯著恢復了細胞的GSH熒光水平并且提高了線粒體膜電位和ATP的水平(P<0.05)，從而提高細胞的活力。此外，試驗數(shù)據(jù)還顯示在過氧化氫的處理下，糖酵解途徑的酶活力得到顯著的激活，而三羧酸循環(huán)中的限速酶活力得到了抑制，在bFGF添加后，糖酵解途徑酶活力恢復正常，由此證明bFGF的加入改善了氧化應激對細胞糖代謝酶活性及途徑的調(diào)控有顯著作用。

4 結(jié)論

該試驗結(jié)果表明，100 ng/L bFGF能夠顯著提高細胞內(nèi)還原當量GSH含量以及降低氧化應激標志物ROS、MDA和8OHdG的相當含量從而對抗細胞的氧化應激，另外，bFGF的添加顯著提高了線粒體膜電位以及ATP和能荷的相對含量，從而提高細胞線粒體的功能，增強細胞活力，最后bFGF的加入顯著改善了氧化應激對細胞糖代謝酶活性造成的不良影響。