李 佳， 陳 琦， 林宇青， 張可鑫， 姜 君*

(1.延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2. 長春市農(nóng)業(yè)科學院,長春 130000)

月見草為一年生或多年生柳葉菜科月見草屬植物，其體內(nèi)所含的多種生物活性成分如γ-亞麻酸[1]、脂肪酸[2]、類固醇[3]已被證實具有抗糖[4]、血脂調(diào)節(jié)[5]、抗血栓[6]等多種功效，月見草黃酮更是一種天然的抗氧化劑，其優(yōu)秀的自由基清除能力被廣泛應用于食品、醫(yī)藥、美容保健等多個領(lǐng)域[7]。

閃式提取法具有操作簡單、耗時少[8]、提取溶劑用量少[9-10]等優(yōu)點。相較于傳統(tǒng)的溶劑提取，閃式提取儀通過機械剪切刀對藥物進行切割，同時利用超速動態(tài)分子的滲透作用，使藥材充分與溶劑作用，能更有效地提取所需活性物質(zhì)[11]。近年來在多糖、多酚、皂苷、黃酮等多種植物源天然產(chǎn)物的提取工藝研究取得了較大進展[12]。曹偉偉對花生殼中總黃酮的閃式提取條件進行篩選，研究得出在最佳提取條件下，花生殼中總黃酮的平均提取率可達到91.91%[13]，高于熱水回流法及超聲提取法[14]。

該試驗探究閃式提取條件對月見草黃酮提取率的影響，采用響應面法對提取工藝進行優(yōu)化，同時通過體外抗氧化試驗比較不同提取條件下的月見草粗提物抗氧化活性，為今后月見草抗氧化產(chǎn)品的工業(yè)化制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

月見草全株購于亳州大德堂藥業(yè)有限公司；ABTS、過硫酸鉀購于索萊寶科技有限公司；甲醇購于天津市科密歐化學試劑有限公司；其他藥品均購于國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗設(shè)計

1) 提取時間的選擇

準確稱取月見草莖、籽粉末10 g分別按液料比1∶30 (g∶mL)的比例加入100%甲醇溶劑于閃式提取器內(nèi)，設(shè)定提取時間為30、40、50、60、70 s，測定不同提取時間對黃酮提取率的影響。

2) 溶劑體積分數(shù)的選擇

準確稱取月見草莖、籽粉末10 g分別按液料比1∶30 (g∶mL)的比例分別加入60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶劑，提取時間設(shè)定為之前所選擇的最佳時間，測定不同溶劑體積分數(shù)下對黃酮提取率的影響。

3) 料液比的選擇

準確稱取月見草莖、籽粉末10 g分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g∶mL)的比例加入甲醇溶劑，提取時間與溶劑濃度均設(shè)置為最佳，測定不同料液比對黃酮提取率的影響。

1.2.2 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以提取時間、甲醇濃度、料液比為響應值，采用三因素三水平響應面分析法，通過Design-Expert.8.06分析軟件對月見草黃酮提取工藝進行響應面優(yōu)化，因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面分析法的因素與水平

1.2.3 溶劑搖床法提取月見草莖、籽總黃酮

準確稱取月見草莖、籽粉末10 g分別按料液比1∶20 (g∶mL)的比例加入100%甲醇溶劑于搖床上提取24 h，過濾、收集上清液，重復3次，最終得月見草莖黃酮提取率為67.6 mg/g，月見草籽黃酮提取率為24.7 mg/g。

1.2.4 總黃酮含量的測定

參考李靜等[15]的方法并有所改進，稱取10 mg蘆丁標準品，使用75%乙醇配制成40 μg/mL的蘆丁標準液，依次取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL的蘆丁標準液于離心管中定容至2 mL，每管依次加入0.3 mL濃度為5%的NaNO2溶液，混勻靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，混勻靜置6 min，最后加入2.0 mL 4% NaOH溶液，混勻后于510 nm下測定吸光度得到標準曲線方程：A=0.029 3 C+0.037 2，R2=0.991 8。根據(jù)標準曲線，計算月見草莖、籽粗提物中的總黃酮含量。

1.2.5 月見草莖、籽提取物對DPPH自由基清除率的測定

參照夏秋霞等[16]的方法并有所改進，樣品稀釋為100、50、25、12、6.25 μg/mL，分別取1 mL樣品與等比例0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液混合，以100%甲醇代替樣品做對照組，混勻后在紫外分光光度計517 nm處測量吸光值。

清除率=(對照組吸光值-樣品組吸光值)/對照組吸光值×100%

1.2.6 月見草莖、籽提取物對ABTS自由基清除率的測定

參照臧永軍等[17]的方法并有所改進，將7 mmol/L ABTS與2.45 mM過硫酸鉀溶液以1∶1的比例混合，避光反應16 h，使用時用無水乙醇將ABTS儲備液稀釋成OD值為(0.70±0.01)的ABTS工作液。將樣品稀釋至1.00、0.50、0.25、0.13和0.06 mg/mL，依次取0.2 mL于離心管中，每只離心管加入2 mL的ABTS工作液，以不加ABTS工作液的樣品溶液為對照組、以不加樣品的ABTS工作液為空白組，于紫外分光光度計734 nm處測量吸光值，計算月見草莖、籽提取物對ABTS自由基的清除率。

清除率=[1-(樣品組吸光值-對照組吸光值)/空白組吸光值]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

由圖1可以看出，月見草莖黃酮提取率隨提取時間、料液比、甲醇濃度的變化先升高后降低，分別在提取時間50 s、料液比1∶20 (g∶mL)、甲醇濃度70%達到最大值32.6、53.6和75.6 mg/g。推測隨提取時間的延長，機械發(fā)熱產(chǎn)生的熱量使樣品中黃酮在高溫下受到一定程度的破壞導致提取率下降；而料液比和甲醇濃度的升高也使樣品中其他可溶物對黃酮產(chǎn)生了競爭性抑制，影響了黃酮提取率。

注：圖中不同字母表示同一因素不同處理條件間差異顯著，即P<0.05，下同

由圖2可以看出，當月見草籽提取時間達到60 s時，總黃酮提取率最高，達到11.6 mg/g；隨著料液比的增加，總黃酮提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，并于料液比1∶20時達到最大值15.4 mg/g；甲醇濃度為70%時，月見草籽中的黃酮提取率顯著高于其它處理組，為26.7 mg/g。因此，選擇提取時間60 s，料液比1∶20，甲醇濃度70%為響應面優(yōu)化因素。

圖2 提取時間(A)、料液比(B)、甲醇濃度(C)對月見草種子提取物中總黃酮產(chǎn)率的影響

2.2 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，對月見草莖的提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見表2。

表2 月見草莖提取的響應面試驗設(shè)計及其結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進一步進行擬合分析，從而得到總黃酮得率的提取時間(A)、料液比(B)及甲醇濃度(C)編碼值的二次回歸模型方程。

總黃酮得率=+73.99+2.08A+0.967 5B+0.627 5C+1.14AB-0.305 0AC-0.195 0BC-2.39A2+0.412 5B2-2.28C2

由月見草莖方差分析結(jié)果可知，該模型回歸顯著(P<0.01)失擬項(P=0.073 6)不顯著，表明自變量與響應值之間的模型關(guān)系顯著，說明回歸方程與實際情況擬合良好，可以用此模型來分析和預測月見草莖總黃酮得率的提取結(jié)果。

由軟件分析各因素對月見草莖總黃酮提取率影響的二維等高線圖及三維響應曲面圖如圖3所示，當提取液濃度取零點值時，提取時間與料液比兩者之間相互影響不顯著，兩者之間的等高線呈現(xiàn)不規(guī)則形；由效應面的陡峭程度可判斷出提取時間與料液比交互作用顯著；當提取時間取零點值時，甲醇濃度與料液比之間的二維等高線無閉合，說明二者之間交互作用不顯著，結(jié)果與方差分析結(jié)果相符。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，對月見草籽的提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果見表3。

表3 月見草種子提取的響應面試驗設(shè)計及其結(jié)果

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件對數(shù)據(jù)進一步進行擬合分析，從而得到總黃酮量提取時間(A)、料液比(B)及甲醇濃度(C)編碼值的二次回歸模型方程，由方差分析結(jié)果得總黃酮得率=+25.72+0.548 8A-0.011 9B-1.09C-1.02AB-2.23AC+0.071 3BC-2.39A2-1.49B2-1.73 C2

由軟件分析各因素對月見草籽總黃酮提取率影響的二維等高線圖及三維響應曲面圖如圖4所示，由效應面的陡峭程度可判斷出提取時間與甲醇濃度交互作用顯著，提取時間與料液比、甲醇濃度與料液比的交互影響不顯著，與方差分析結(jié)果相符。

圖3 月見草莖提取的響應面分析圖及等高線分布圖

2.3 最優(yōu)提取工藝驗證

擬合的最優(yōu)結(jié)果及結(jié)果驗證如表4～5所示，由于時間無法精準把控，故在實際工藝上進行了調(diào)整。最終月見草莖在提取時間50 s、料液比1∶19.4 (g∶mL)、甲醇濃度68%時黃酮提取率為75.6 mg/g；月見草籽在提取時間61 s、料液比1∶20.3 (g∶mL)、甲醇濃度71%時黃酮提取率達到25.8 mg/g，遠優(yōu)于搖床法。

圖4 月見草種子提取的響應面分析圖及等高線分布圖

表4 月見草莖提取的響應面分析結(jié)果的驗證

表5 月見草種子提取的響應面分析結(jié)果的驗證

2.4 月見草莖、籽提取物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定

不同濃度與不同提取工藝的月見草莖提取物清除DPPH自由基能力如圖5所示。從圖5可以看出，月見草莖提取物對DPPH自由基的清除能力隨濃度升高而增加，閃式提取法清除能力略低于VC，遠高于搖床法，高濃度下幾乎與VC持平；說明在這一濃度下，閃式提取法的月見草莖提取物有著較好的DPPH自由基清除率。

圖5 月見草莖提取物對DPPH自由基清除活性的影響

不同濃度與不同提取工藝的月見草籽提取物清除DPPH自由基能力如圖6所示。由圖6可知，月見草籽提取物有一定的DPPH清除能力，但低濃度表現(xiàn)不佳，與VC之間仍有差距；其中，閃式提取法的月見草籽提取物對DPPH的清除能力最佳，遠高于搖床提取。高濃度的月見草籽提取物或可用以替代VC的DPPH清除作用。

圖6 月見草種子提取物對DPPH自由基清除活性的影響

2.4.2 ABTS自由基清除能力的測定

由圖7可知，VC和月見草莖提取物對ABTS自由基均表現(xiàn)出良好的清除能力，且呈量效關(guān)系，閃式提取法所得提取物對ABTS自由基的清除能力略低于VC，略高于搖床法。2種提取方法下的提取物ABTS自由基清除力基本持平，說明搖床法并不會過多損傷月見草莖的ABTS自由基清除能力。

圖7 月見草莖提取物對ABTS自由基清除活性的影響

由圖8可知，月見草籽提取物的對ABTS自由基有一定的清除力，且隨著質(zhì)量濃度的升高也在不斷增強，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)、高濃度下閃式提取法與搖床法對ABTS自由基的清除力幾乎一致，但仍然低于對照品VC的清除力。

圖8 月見草種子提取物對ABTS自由基清除活性的影響

3 討論與結(jié)論

近年來，植物有效物質(zhì)的提取主要有水提法、有機溶劑提取法、酶提法和超聲波輔助提取法，但普遍存在提取時間長、耗材量大、提取效率低、產(chǎn)物活性差等種種弊端[18]。閃式提取作為一種新興提取方式，利用負壓滲透作用和高速剪切作用，促進植物細胞快速破壁粉碎，在短時間內(nèi)使植物組織與提取溶劑充分作用，耗時更短、提取效率更高、能最大限度保護植物有效成分[19]。

而響應面實驗設(shè)計通過擬合各因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，借以推測出閃式提取月見草莖、籽黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)：當提取條件為提取時間50.32 s，料液比1∶19.4 (g∶mL)，甲醇濃度68%時月見草莖的總黃酮提取率為76.8 mg/g，當提取條件為提取時間60.72 s，料液比1∶20.3 (g∶mL)，甲醇濃度71%時月見草籽的總黃酮提取率為27.1 mg/g，顯著高于其它提取條件所得總黃酮[20]。且經(jīng)該提取方法所得粗提物已被驗證有較好的抗氧化活性[21-22]，為其在食品、藥品等領(lǐng)域開發(fā)天然抗氧化劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。