水稻營養(yǎng)器官鎘積累特性對稻米鎘含量的影響

張昕，張長波，黃永春，王常榮，薛衛(wèi)杰，劉仲齊

（農業(yè)農村部產地環(huán)境污染防控重點實驗室，農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191）

隨著我國工業(yè)化和城鎮(zhèn)化的快速發(fā)展，廢棄物排放量顯著增加，由此導致的土地重金屬污染受到人們的廣泛關注。鎘是重金屬污染土壤中最常見的元素之一，具有較高的可移動性，可以通過自由擴散或載體蛋白運輸?shù)姆绞竭M入植物根系，再通過質外體和共質體途徑向木質部轉運，最后轉運至植物的可食用部分，通過食物鏈傳遞，危害人體健康。水稻是我國第一大糧食作物，也是全球食用量最高的谷物，因此探究稻米積累鎘的特性、篩選低鎘積累水稻基因型對于保證稻米品質安全具有重要意義。

水稻積累鎘的能力受環(huán)境因素和基因型的共同調控。環(huán)境因素中土壤有效態(tài)鎘含量、生長季節(jié)、水分管理措施等影響水稻根系對鎘的吸收，在多個地點同時種植早稻和晚稻，發(fā)現(xiàn)晚稻各器官中的鎘含量通常高于早稻。水稻根系對鎘的阻控能力、葉片對鎘的耐受程度以及鎘在水稻各器官內的積累量和分配比例均存在基因型差異。在鎘污染環(huán)境中，水稻根系通過根表鐵錳膜攔截和細胞壁固定等方式阻控鎘進入根系維管束的過程，地上部各器官會對鎘進行層層固定和攔截，只有少數(shù)鎘離子轉運到稻米中。水稻開花以后，發(fā)育籽粒成為代謝中心，葉片和莖稈中儲備的各種營養(yǎng)物質開始向籽粒轉運，鎘會隨著錳、鋅等營養(yǎng)元素一起轉運至籽粒中。灌漿期間的物質流向及其生理調控機制較為復雜，發(fā)育籽粒的選擇性吸收、營養(yǎng)器官中的礦質元素含量以及葉片蒸騰速率等因素都會影響鎘向籽粒的轉運，鎘在籽粒中積累量易受水稻發(fā)育狀態(tài)和自然因素的干擾。稻穗離體培養(yǎng)法常用來進行營養(yǎng)生理和抗逆生理的研究，是否可以快速鑒別稻穗各部位鎘積累特性及其在水稻基因型間的差異，尚未見報道。以高鎘和低鎘積累品種為試驗材料，將離體稻穗放置在鎘脅迫強度相同的環(huán)境中進行鎘轉運特性的比較，可以最大限度地排除環(huán)境因素的干擾和下部器官鎘含量的差異對上部器官鎘吸收轉運特性的影響，可用于探究穗下節(jié)和穗頸等器官對籽粒鎘積累量的貢獻率，比較籽?；烤S管束鎘攔截特性在基因型間的差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與地點

以“朝陽 1 號 B”（61）、“湘早秈 24”（X24）和“T 優(yōu)705”（R705）3 種水稻基因型為試驗材料，其中X24 和R705 為湖南省大面積推廣的秈稻，X24 為低鎘積累水稻，R705 為高鎘積累水稻。61 是來自國家水稻核心資源庫的地方品種。

離體稻穗和離體葉片試驗在農業(yè)農村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所（簡稱環(huán)保所）人工氣候室內進行，盆栽試驗在環(huán)保所玻璃溫室中進行。

1.2 培養(yǎng)與處理方法

挑選飽滿的水稻種子，在體積分數(shù)為5%的HO溶液中浸泡30 min進行消毒，隨后將種子沖洗干凈并在育苗盤上進行萌發(fā)。待種子發(fā)芽后移入蛭石盤中進行自然生長，期間用四分之一Hoagland 營養(yǎng)液澆灌。水稻生長至20 cm 左右時，將離體稻穗和離體葉片試驗所需要的水稻人工插秧至環(huán)保所溫室內的無污染試驗田中，基因型間設置空行；盆栽試驗所需水稻插秧至土培盆中，每盆10 株，每個基因型設置4 個重復。盆栽試驗的土壤采自于天津市某土壤污染區(qū)0~20 cm 的表層土，鎘含量為 1.2 mg·kg，pH 為 7.5 左右；盆體積為8 L，每盆裝土4.0 kg。生長期間澆灌保持水深2 cm 左右。水稻成熟后將其從土壤中連根拔出，洗凈根表殘留土壤，烘干至恒質量后分樣，測定各器官鎘含量。

于水稻開花期對無污染試驗田中同日開花的稻穗進行標記，開花后15 d，將稻穗從倒一節(jié)下0.5 cm處剪斷，去除葉鞘和葉片，進行離體稻穗試驗。將稻穗放入含有不同鎘濃度的十分之一Hoagland 營養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d，處理液中的鎘（CdCl·2.5HO）濃度設置為 5 個梯度，分別是 0.9、1.8、2.7、3.6 μmol·L和 4.5μmol·L，處理 2.5 d 時更換一次處理液。樣品在75 ℃的恒溫烘箱中烘干至恒質量，測定鎘含量。

1.3 鎘含量的測定

參照本實驗室原有的方法，稱取穗軸和籽粒干樣各0.5 g 于消解管中，加7 mL MOS 級硝酸過夜，次日于ED54 電熱消解儀上保持110 ℃進行消解，2.5 h 后冷卻消煮管，加入1 mL 過氧化氫溶液，待反應平緩后，繼續(xù)保持110 ℃消解1.5 h，隨后將儀器升溫至165 ℃趕酸，用去離子水沖洗消煮管，定容至25 mL后轉移至塑料小白瓶保存消解液，用原子吸收儀（AAS ZEEnit 700）測定樣品鎘含量。

1.4 葉綠素含量的測定

稱取離體葉片鮮樣0.1 g于95%乙醇中研磨，過濾定容至25 mL，將95%乙醇設置為空白對照，用紫外分光光度計（UV-2010 型）分別在波長665 nm 和649 nm處用測定樣品光密度OD值，計算葉綠素含量。

1.5 氧化損傷的測定

將鎘溶液中處理過的新鮮葉片浸泡在10μmol·L的HDCFDA 溶液中，避光孵育2 h，染色后用滅菌后的去離子水清洗干凈，將樣品放置在20%的甘油中保存，防止葉片脫水卷曲。將葉片固定在載玻片上，在三目倒置熒光顯微鏡（測維光電LWD300-38LT）488 nm 處觀察，綠色熒光的分布和強度代表葉肉細胞中HO的位置和數(shù)量。

1.6 數(shù)據統(tǒng)計及分析

轉移系數(shù)（）=a器官鎘積累量/b器官鎘積累量

葉綠素 a（鮮質量）（mg·g）=（11.75×A665-2.35×A649）×0.1

葉綠素b（鮮質量）（mg·g）=（18.61×A649-3.96×A665）×0.1

葉綠素總量（鮮質量）（mg·g）=葉綠素 a 含量+葉綠素b含量

采用Excel 對數(shù)據進行處理并完成繪圖，采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析（One-way ANO?VA）、差異顯著性檢驗（Duncan，<0.05）及相關性分析（Pearson）。

2 結果與分析

2.1 水稻各器官鎘含量的基因型差異

水稻莖稈由節(jié)間和節(jié)構成，節(jié)上著生葉和芽。莖基部有7~13個節(jié)間不伸長，稱為蘗節(jié)，是攔截鎘的主要部位。在鎘含量為 1.2 mg·kg、pH 為 7.5 左右的土壤中進行盆栽試驗，發(fā)現(xiàn)水稻成熟期61 和X24 的籽粒、穗軸和莖基中的鎘含量均顯著低于R705，61 和X24 各器官鎘含量無顯著差異（圖1A）。轉移系數(shù)代表鎘在器官間的轉運能力，其數(shù)值越大表示鎘的轉運能力越強。鎘從穗軸向籽粒的轉運效率明顯高于從莖基向穗軸的轉運（圖1B）；在3 個基因型之間無顯著差異，61 和 X24 的顯著低于 R705。說明R705穗軸和籽粒基部攔截鎘的能力較61和X24弱，其莖基攔截鎘的貢獻率更大。

圖1 3個基因型水稻籽粒、穗軸、莖基鎘含量以及轉移系數(shù)在基因型間的差異Figure 1 Cadmium content in grains,rachises and basal stems among three genotypes and transfer factor of cadmium between different organs

2.2 離體稻穗鎘的吸收動力學特征

水稻離體稻穗在含鎘0.9~4.5μmol·L的處理液中培養(yǎng)5 d 后，計算鎘的平均流速（μmol·g·h），發(fā)現(xiàn)隨著處理液中鎘濃度的升高，3 個基因型水稻籽粒中鎘的吸收動力學特征均符合線性方程=a+b（圖2A）。處理液中鎘濃度每增加 1 μmol·L，X24 和R705 籽粒中的鎘積累速率約增加0.44~0.49 μmol·g·h，而 61 籽粒中的鎘積累速率只增加0.14 μmol·g·h。穗軸中的鎘積累速率顯著大于籽粒，其中X24 和R705 穗軸鎘的吸收動力學特征符合線性方程，61 穗軸鎘的吸收動力學特征符合指數(shù)方程（圖2B）。當處理液中的鎘濃度低于2.7μmol·L時，穗軸鎘積累速率隨著處理液中鎘濃度提高而增加的幅度較小，積累速率的增長幅度在3 個基因型間差異不顯著；當處理液中的鎘濃度增加至3.6μmol·L后，61穗軸中的鎘積累速率提升加快。處理液中的鎘濃度相同時，61 穗軸鎘積累速率始終高于X24 和R705。在0.9μmol·L鎘脅迫下，3個基因型水稻籽粒吸收鎘的最大速率為2.03~4.58 μmol·g·h，穗軸吸收鎘的最大速率為11.54~15.62 μmol·g·h，在4.5 μmol·L鎘脅迫下，3 個基因型水稻籽粒吸收鎘的最大速率為2.53~6.16 μmol·g·h，穗軸吸收鎘的最大速率為23.84~53.11 μmol·g·h。

離體稻穗籽粒中的鎘含量在基因型間表現(xiàn)出顯著差異。當處理中的鎘濃度為0.9~4.5 μmol·L時，R705 籽粒中的鎘含量高于61 和X24 籽粒中鎘含量（圖2C）。61籽粒中的鎘含量在處理間的差異未達顯著水平，X24 和R705 籽粒中的鎘含量都隨著處理液中鎘濃度的增加而顯著升高。當處理液的鎘濃度為4.5 μmol·L時，籽粒中鎘含量在基因型間的差異最為明顯，61 和X24 籽粒中的鎘含量分別為0.03 mg·kg和 0.06 mg·kg，而 R705 籽粒中的鎘含量達到0.08 mg·kg；R705 的籽粒鎘含量是 61 籽粒鎘含量的2.44倍，是X24籽粒鎘含量的1.29倍。

處理液濃度對離體稻穗穗軸鎘含量的影響在基因型間表現(xiàn)出差異。61 穗軸中鎘含量在各濃度鎘脅迫下均高于X24 和R705 穗軸鎘含量（圖2D）。隨處理液中鎘濃度升高，61 和X24 穗軸中鎘含量顯著增加，而R705 穗軸中鎘含量在低鎘濃度脅迫下增加不顯著，當處理液中鎘濃度達到4.5μmol·L時鎘含量顯著增加。在0.9μmol·L鎘脅迫下，穗軸鎘含量在基因型間差異不明顯，為0.16~0.21 mg·kg。在4.5 μmol·L鎘脅迫下，61 穗軸鎘含量則明顯高于X24 和 R705 穗軸鎘含量，達到 0.72 mg·kg，X24 和R705 穗軸鎘含量差異不明顯，鎘含量為0.35 mg·kg左右。

圖2 3個基因型離體稻穗籽粒和穗軸中鎘的積累速率及鎘含量Figure 2 Accumulation rate of cadmium in detached grains and rachises among three genotypes，contents of cadmium in detached grains and rachises among three genotypes

2.3 離體稻穗鎘轉運特性的基因型差異

穗軸是穗節(jié)和穗頸中各種離子向籽粒輸送的末端出口。分別對3 個基因型離體稻穗籽粒和穗軸鎘含量進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)都符合線性方程=a+b，但斜率在基因型間有顯著差異（圖3A）。61的斜率顯著小于X24 和R705，穗軸中鎘含量每增加1.0 mg，61籽粒中鎘含量增加0.01 mg，X24 籽粒中鎘含量增加0.11 mg，R705籽粒中鎘含量增加0.14 mg。說明61籽?；繉︽k的攔截能力顯著大于X24 和R705，R705籽粒基部對鎘的攔截能力最弱。

轉移系數(shù)是判斷穗軸向籽粒轉運鎘能力的重要依據，對5 個濃度鎘脅迫下穗軸向籽粒的轉移因子進行計算，發(fā)現(xiàn)隨處理液中鎘濃度增加，3 個基因型均逐漸減小，但轉運能力在基因型間存在顯著差異；在相同濃度鎘脅迫下，61 和 X24 的均顯著低于 R705，且 61 的顯著低于 X24（圖3B）。在 0.9 μmol·L鎘脅迫下，61 的為0.13，X24 和 R705 的分別為 0.25 和 0.37，是61 的 1.92 倍和2.84 倍；當鎘脅迫提高到4.5 μmol·L時，X24 和 R705 的下降到 0.17 和 0.25，但仍大于61在低鎘脅迫時的。在4.5 μmol·L鎘脅迫下，61的僅有0.05。

圖3 籽粒和穗軸鎘含量相關性及TF 籽粒/穗軸的基因型差異Figure 3 Relationship between cadmium content of grains and rachises,transfer factors of cadmium from rachises to grains among three genotypes

2.4 不同基因型離體葉片鎘積累特性的差異

離體葉片浸泡在0.9~4.5μmol·L的鎘溶液中培養(yǎng)3 d后，會隨鎘脅迫增強和時間推移而逐漸變黃（圖4A）。3個基因型水稻在自然生長條件下葉片顏色較為均一，施加不同濃度鎘脅迫后，X24 和61 在中等濃度的鎘脅迫下就出現(xiàn)失綠現(xiàn)象，且失綠速率快，說明X24 和61 對鎘脅迫更加敏感。X24 在鎘脅迫達到13.5μmol·L時出現(xiàn)明顯的失綠現(xiàn)象；61在鎘脅迫達到 18.0 μmol·L時葉片黃化較為嚴重；R705 葉片在高鎘脅迫下仍保持綠色。

圖4 三個基因型離體葉片失綠情況、鎘含量、失綠速率及離體葉片鎘含量和葉綠素含量相關性Figure 4 Etiolating of detached leaves,cadmium content and leaf chlorosis rate of detached leaves among three genotypes,relationship between cadmium content of detached leaves and chlorophyll content of detached leaves

離體葉片處理3 d 后測定鎘積累量，發(fā)現(xiàn)離體葉片鎘含量隨處理液鎘濃度升高而增加，并且在基因型間存在差異（圖4B）。在0.9 μmol·L鎘脅迫下，R705鎘含量最低，但3 個基因型間無顯著差異；當鎘脅迫濃度在4.5~18.0 μmol·L之間時，R705鎘含量始終高于61 和X24。基因型間鎘含量差異在18.0 μmol·L鎘脅迫時達到最大，R705 鎘含量分別是61 和X24 的1.48 倍和1.70 倍。R705 離體葉片鎘積累的速率比61和X24快，61和X24離體葉片在低鎘濃度下鎘積累速率緩慢且穩(wěn)定。

葉片受到鎘脅迫后，葉綠體被損壞并分解，葉片失綠狀態(tài)反映其耐鎘特性，計算離體葉片失綠速率，發(fā)現(xiàn)隨鎘脅迫增強，3 個基因型離體葉片失綠速率均顯著加快，且隨鎘脅迫增強失綠速率加快幅度增大（圖4C）。在鎘脅迫濃度低于 9.0 μmol·L時，3 個基因型離體葉片失綠速率均較慢。當鎘脅迫濃度達到13.5 μmol·L時，61 和 X24 失綠速率加快，分別是R705 的 1.60 倍和 1.90 倍。在 18.0 μmol·L鎘脅迫時，R705失綠速率也顯著加快。

對離體葉片中鎘含量和葉綠素含量進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)二者呈現(xiàn)負相關性，相關性符合線性方程=a+b（圖4D）。斜率反映了葉綠素含量降低的幅度，R705 的斜率最小，其葉片每吸收1 mg 的鎘，其葉綠素含量降低0.01 mg，61 和X24 的葉片每吸收1 mg的鎘，葉綠素含量降低0.02 mg。說明61 和X24 葉片對鎘脅迫的敏感性較強，R705 葉片對鎘毒害的反應較為遲鈍。

2.5 離體葉片耐鎘能力的基因型差異

3 討論

在相同的自然環(huán)境中，低鎘積累品種的稻米鎘含量顯著低于高鎘積累品種，但稻米鎘含量的遺傳穩(wěn)定性很差，同一品種的稻米鎘含量在不同年份和不同地點可以相差2~4倍。在盆栽試驗中表現(xiàn)為低鎘積累的品種，在田間試驗中未必表現(xiàn)出低鎘積累特性。然而，無論是田間試驗還是盆栽試驗，水稻穗軸和籽粒中的鎘含量總是高度線性相關，灌漿期高鎘積累品種營養(yǎng)器官的鎘輸出量總是顯著高于低鎘積累品種。為了排除環(huán)境因素的干擾，本研究將不同品種的稻穗及穗下節(jié)浸泡在相同濃度鎘溶液中，比較稻米鎘含量在水稻基因型間的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)離體稻穗籽粒和穗軸的鎘含量均隨鎘濃度的增強而增加，高鎘積累水稻T 優(yōu)705 籽粒鎘含量顯著高于低鎘積累品種湘早秈24和朝陽1號B籽粒鎘含量，這說明在下部營養(yǎng)器官鎘含量相同的情況下，高鎘積累水稻的籽粒和穗軸吸收轉運鎘的能力更強。根據離體稻穗籽粒鎘含量的高低，可以區(qū)分高鎘和低鎘積累品種，為快速篩選種質資源提供新的思路和依據。

水稻根系從環(huán)境中吸收鎘離子后，會把大部分鎘離子轉化成難溶態(tài)鎘固定在根系組織中，只有少數(shù)可溶態(tài)鎘被轉運到地上部，莖基部壓縮的蘗節(jié)和地上伸長的4~5 個節(jié)間以及節(jié)和葉片會繼續(xù)對鎘進行層層攔截，將其儲存在莖基、節(jié)和葉片中。水稻開花以后，莖葉中儲存的部分鎘離子被活化，和錳、鋅等營養(yǎng)元素一起向穗軸和稻米中轉運。鎘和營養(yǎng)物質流經穗軸維管束到達籽?；?，籽粒基部對轉運而來的小分子化合物進行選擇性吸收后運輸至籽粒內部。本研究發(fā)現(xiàn)，鎘從3 個基因型水稻的莖基向穗軸轉運的比例（）均小于，說明水稻莖基對鎘的固定能力較強，能有效減少鎘向上部器官轉運。在離體稻穗試驗中，高鎘積累水稻T優(yōu) 705 的顯著高于低鎘積累品種湘早秈 24和朝陽1 號B，說明T 優(yōu)705 籽粒基部對鎘的攔截作用較弱。由此可見，籽粒基部對鎘具有識別和攔截作用，根據鎘濃度在籽粒和穗軸間的比例可以快速判斷發(fā)育籽粒鎘積累特性在基因型間的差異，從而篩選籽?；繉︽k的攔截能力較強的低鎘積累品種。

4 結論

（1）根據離體稻穗稻米和穗軸中的鎘含量，可以快速準確地區(qū)分高鎘積累和低鎘積累基因型。離體稻穗在含鎘營養(yǎng)液中灌漿時，稻米和穗軸鎘含量顯著線性相關，穗軸鎘含量每增加1.0 mg，朝陽1 號B、湘早秈24 和T 優(yōu)705 籽粒中的鎘含量分別增加0.01、0.11 mg和0.14 mg。

（2）稻米鎘含量由水稻各器官鎘含量和鎘在器官間的轉運能力共同決定。低鎘積累型水稻湘早秈24和朝陽1 號B 莖基、穗軸和籽粒中鎘含量均顯著低于高鎘積累型水稻T 優(yōu)705，且湘早秈24 和朝陽1 號B籽?；繑r截鎘的能力強于T優(yōu)705。