一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定葆腎合劑中5種成分的含量

馮子芳 費(fèi)逸明 袁曉航 陳曉偉 胡敏敏 劉麗萍

[摘要]目的建立一測(cè)多評(píng)（QAMS）法同時(shí)測(cè)定葆腎合劑中綠原酸、咖啡酸、意苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷5種成分的含量。方法選取Waters XBridge C₁₈色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙睛（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫。以綠原酸為內(nèi)參物，建立相對(duì)校正因子，計(jì)算其含量，比較外標(biāo)法與QAMS法的差異性。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、意苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷在范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9996），不同實(shí)驗(yàn)條件下相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)得值之間無(wú)顯著性差異（RAD<2%）。結(jié)論建立的一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于葆腎合劑中5種活性成分的同時(shí)測(cè)定，實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]一測(cè)多評(píng)法;葆腎合劑;相對(duì)校正因子;質(zhì)量控制

[中圖分類(lèi)號(hào)]R286.0??? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A??? [文章編號(hào)]2095-0616（2022）01-0051-05

Simultaneous determination of five ingredients in Baoshen mistura by quantitative analysis of multi-components by single marker

FENG Zifang1??? FEI Yiming1??? YUAN Xiaohang1??? CHEN Xiaowei1??? HU Minmin1??? LIU Liping2

1. Wuxi Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Wuxi 214000，China;2. Jiangsu Vocational College of Medicine，Jiangsu，Yancheng 224005，China

[Abstract]Objective To establish a quantitative analysis of multi-components by single marker （QAMS）method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，caffeic acid，coixol，ellagic acid and mullein isoflavone glucoside in Baoshen mistura. Methods A Waters XBridge C₁ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）was selected with the mobile phase of acetonitrile （A）- 0.2% phosphoric acid water （B），and the gradient elution was performed. The chlorogenic acid was used as the internal reference，and the relative correction factors were set for the calculation of the content of chlorogenic acid，and the differences between the external standard method and QAMS method were compared. Results The chlorogenic acid，caffeic acid，coixol，ellagic acid and mullein isoflavone glucoside showed good linearity within a certain range （r≥0.9996）. There was a good reproducibility in the relative correction factors under different experimental conditions，and there was no significant difference in the values measured by the QAMS method and the external standard method （RAD<2%）. Conclusion The established QAMS method is accurate with good reproducibility，which can be used for the simultaneous determination of the five active ingredients in Baoshen mistura to achieve quality control.

[Key words]Quantitative analysis of multi-components by single marker;Baoshen mistura;Relative correction factor;Quality control

葆腎合劑是無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院治療早中期慢性腎臟病的基本方，處方由芡實(shí)、覆盆子、黃芪、米仁根、僵蠶、金櫻子、石韋7味中藥組成，功能健脾益腎、清熱利濕，臨床療效較好[1]。中藥制劑的特點(diǎn)是多成分、多靶點(diǎn)，如果只測(cè)定某一成分，很難準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)其質(zhì)量[2-4]，—測(cè)多評(píng)法（QAMS）通過(guò)選擇某一質(zhì)量穩(wěn)定、對(duì)照品價(jià)廉易得、臨床療效確切的組分作為內(nèi)參物，實(shí)現(xiàn)對(duì)該制劑所含多個(gè)組分同時(shí)測(cè)定的目的。本試驗(yàn)以葆腎合劑為研究對(duì)象，以綠原酸為內(nèi)參物，建立其他成分與其的相對(duì)校正因子[5]，進(jìn)行定量計(jì)算，為全面控制制劑質(zhì)量，保證臨床療效奠定基礎(chǔ)[6-7]。

1??? 儀器與試藥

1.1??? 儀器

BSA224S-CW電子天平（德國(guó)Sartorius公司）;Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），DAD二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）;DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）;KQ-100型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率：100W，頻率：40 kHz）。1.2??? 試藥

試驗(yàn)用七味藥材，經(jīng)副主任中藥師鑒定合格，并且均由蘇州天靈中藥飲片有限公司提供;薏苡素對(duì)照品（批號(hào)：J24M10L89214，供含量測(cè)定用，純度≥98%）;咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)：W16010B100366，供含量測(cè)定用，純度≥98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753- 201817，供含量測(cè)定用，純度96.8%），鞣花酸對(duì)照品（批號(hào)：111959-201602，供含量測(cè)定用，純度98.3%）;毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201606，供含量測(cè)定用，純度97.6%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;水為超純水;乙腈（色譜純，美國(guó)Fisher公司）;其余試劑均為分析純。

試驗(yàn)中用到的樣品溶液，是制劑室根據(jù)處方，加10倍量水，浸泡30 min，每次煎煮2 h，煎煮3次，制成每瓶200 ml，共10個(gè)批次，批號(hào)分別為：20201221，20201222，20201223，20201224，20201225，20201226，20201227，20201228，20201229，20201230。

2??? 方法與結(jié)果

2.1??? 色譜條件[8]

色譜柱：Waters XBridgeC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)分別為326 nm （0～26 min：檢測(cè)綠原酸、咖啡酸、薏苡素）和254 nm（26～65 min：檢測(cè)鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷），流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）;梯度洗脫（0～10 min，92%B;10～12 min，92%B～89%B;12 ～50 min，89%B;50～65 min，89%B～80%B）;進(jìn)樣體積10 μl;流速1.0 ml/min;分析時(shí)間65 min，色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2??? 混標(biāo)的制備[9]

以甲醇為溶媒，分別精密稱(chēng)取咖啡酸、綠原酸、鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖昔和薏苡素對(duì)照品適量，制成每毫升含咖啡酸1.56 mg、綠原酸3.50 mg、鞣花酸0.84 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖昔2.35 mg和慧苡素1.20 mg的溶液，搖勻，備用。

2.3??? 供試品溶液的制備

精密吸取10批樣品溶液各1.5 ml，置于5 ml容量瓶中，加甲醇，超聲10 min，放冷后定容，搖勻，微孔濾膜濾過(guò)，得供試品溶液。

2.4??? 陰性對(duì)照溶液的制備

參照葆腎合劑的處方，制備缺石韋、米仁根、金櫻子、覆盆子和黃芪的陰性樣品，依據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5??? 方法學(xué)考察[9]

2.5.1??? 線性關(guān)系考察??? 精密吸取“2.2”項(xiàng)下適量混標(biāo)溶液，加甲醇稀釋成不同濃度，微孔濾膜濾過(guò)，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，記錄峰面積。以各對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），得到如下線性方程：綠原酸為Y=8.590X+85.662，r=0.9998，線性范圍6.99～135.21 μg/ml;咖啡酸為Y=27.539X+96.017，r=0.9996，線性范圍3.35～61.26 μg/ml;薏苡素為Y=9.153X-2.534，r=0.9999，線性范圍4.00～46.44 μg/ml;鞣花酸為Y=97.778X-62.964，r=0.9999，線性范圍1.81～33.13 μg/ml;毛蕊異黃酮葡萄糖苷為Y=21.464X+13.772，r=0.9998，線性范圍5.03～91.88 μg/ml，在上述范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2??? 精密度試驗(yàn)??? 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混標(biāo)溶液，按照色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄咖啡酸、綠原酸、鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和薏苡素的峰面積，結(jié)果RSD值分別為1.43%、0.32%、0.49%、0.64%和0.51%，表明精密度良好。

2.5.3??? 重復(fù)性試驗(yàn)??? 參照“2.3”項(xiàng)下方法，取葆腎合劑樣品溶液（批號(hào)：20201225），平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄咖啡酸、綠原酸、鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和薏苡素的峰面積，結(jié)果RSD值分別為1.84%、1.34%、2.07%、2.51% 和0.59%，表明重復(fù)性良好。

2.5.4??? 穩(wěn)定性試驗(yàn)??? 取葆腎合劑樣品溶液（批號(hào)：20201225），分別在0、1、2、4、8、16 h進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果咖啡酸、綠原酸、鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖昔和薏苡素峰面積的RSD值分別為1.54%、0.97%、2.14%、0.86%和1.77%，表明16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5??? 加樣回收率試驗(yàn)??? 按葆腎合劑樣品溶液有效成分含量1：1的比例，精密加入混標(biāo)溶液，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果咖啡酸、綠原酸、鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和薏苡素的平均加樣回收率（RSD值）分別為97.15%（1.28%）、98.46%（1.36%）、102.17%（2.44%）、96.88%（2.36%）和99.06%（2.59%）。

2.6??? 測(cè)定相對(duì)校正因子（RCF）[10]

精密吸取混標(biāo)溶液，進(jìn)樣分析，以綠原酸為內(nèi)參物，按照RCF計(jì)算公式（1），分別計(jì)算咖啡酸、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的相對(duì)校正因子RCF。

f_k/s=f_k/f_s=（C_k×A_s）/（C_s×A_k）（1）

式中Ak為內(nèi)參物峰面積，Ck為內(nèi)參物的質(zhì)量濃度，As為目標(biāo)成分的峰面積，Cs為目標(biāo)成分的質(zhì)量濃度，見(jiàn)表1。

2.7??? 相對(duì)校正因子耐用性考察

取混標(biāo)溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，考察2個(gè)品牌的高效液相色譜儀：Agilent 1200型和Waters e2695 型，3 種色譜柱：YMC-Pack ODS-AC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）;Agilent Eclipse XDB-C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters XBridgeC₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)RCF的影響，見(jiàn)表2。

2.8??? 待測(cè)組分色譜峰的定位[11]

采用相對(duì)保留時(shí)間值法對(duì)待測(cè)成分綠原酸、咖啡酸、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖昔色譜峰進(jìn)行定位，以?xún)?nèi)參物綠原酸色譜峰為基準(zhǔn)峰，考察不同儀器、不同色譜柱條件下5種成分色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間值，見(jiàn)表3。

2.9??? 含量測(cè)定

取10批樣品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，分別采用外標(biāo)法（ESM）和一測(cè)多評(píng)（QAMS）法計(jì)算待測(cè)目標(biāo)成分的含量，并進(jìn)行比較，兩種方法所測(cè)結(jié)果的偏差（RAD）均<2.0%，見(jiàn)表4。

3??? 討論

3.1??? 指標(biāo)性成分的確定

葆腎合劑是由芡實(shí)、黃芪等7味藥材制成的復(fù)方制劑，芡實(shí)為制劑中的君藥，主要含有碳水化合物（82.6%）[12];黃芪主要活性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷，具有抗損傷、免疫調(diào)節(jié)等功效[13];米仁根有效成分薏苡素，具有清熱利濕、健脾和殺蟲(chóng)等功效[14];金櫻子、覆盆子“益腎臟而固精”，其所含的鞣花酸具有良好的抗炎和抗菌作用等[15-16];石韋甘苦微寒，其中綠原酸有降壓等作用，咖啡酸能抗炎抗病毒[17]，助米仁根清利濕熱為佐藥，故選擇這幾個(gè)作為指標(biāo)成分進(jìn)行定量控制。

3.2??? 色譜峰定位及系統(tǒng)耐用性的考察

對(duì)于色譜峰定位，以綠原酸為基準(zhǔn)峰，對(duì)各待測(cè)成分色譜峰，采用相對(duì)保留時(shí)間值（待測(cè)成分與內(nèi)參物保留時(shí)間之比）進(jìn)行定位，結(jié)果待測(cè)成分的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均<3%，色譜峰出峰先后順序沒(méi)有變化，表明穩(wěn)定性較好，可用于色譜峰的定位[18-19]。

4??? 小結(jié)

課題組前期已進(jìn)行指紋圖譜的相關(guān)研究[20]，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法建立葆腎合劑一測(cè)多評(píng)（QAMS）的含量測(cè)定方法，方法穩(wěn)定，簡(jiǎn)便可行。一測(cè)多評(píng)法（QAMS）是選擇一種成分作為內(nèi)參物，同時(shí)測(cè)定多個(gè)成分，最終實(shí)現(xiàn)中藥整體質(zhì)量的控制，目前已經(jīng)用于中藥材、中藥飲片及中藥制劑的成分測(cè)定。

葆腎合劑為無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院腎病科的經(jīng)驗(yàn)方，有著良好的臨床療效和應(yīng)用前景，本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定葆腎合劑中5種成分的一測(cè)多評(píng)法（QAMS），對(duì)其耐用性進(jìn)行考察，將一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的含量與外標(biāo)法所測(cè)得含量值，采用相對(duì)平均偏差進(jìn)行比較（RAD<2%），無(wú)顯著差異，表明該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可實(shí)現(xiàn)5個(gè)成分的定量測(cè)定，符合中藥多組分特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式[21]，可以有效用于葆腎合劑的質(zhì)量控制。但由于條件受限，有些成分未能測(cè)定含量，未來(lái)將進(jìn)一步完善該品種含量測(cè)定研究。

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