線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血模型的體會(huì)

袁柳媚 盧小葉 夏云 戴雅婷 范宓 婁必丹

[摘要]線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血模型因無需開顱，并且具有梗死體積相對(duì)穩(wěn)定、可重復(fù)性高、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，目前在國內(nèi)應(yīng)用廣泛。該模型是公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ妥罾硐氲哪Ｐ椭?。筆者結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和既往文獻(xiàn)報(bào)道，從大鼠的選擇、模型制備以及術(shù)后死亡、并發(fā)癥的原因分析與處理等多個(gè)方面分享線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血模型的體會(huì)。通過不斷改進(jìn)術(shù)中操作方法、及時(shí)有效地處理術(shù)后并發(fā)癥引起的相關(guān)癥狀，提高了大鼠的術(shù)后存活率。

[關(guān)鍵詞]線栓法;大腦中動(dòng)脈閉塞;腦缺血;動(dòng)物模型;大鼠

[中圖分類號(hào)]R-332;R743??? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A??? [文章編號(hào)]2095-0616（2022）02-0007-04

Experience of the establishment of cerebral ischemia model of middle cerebral artery occlusion in rats using suture-occluded method

YUAN Liumei1??? LU Xiaoye1??? XIA Yun2??? DAI Yating1??? FAN Mi1??? LOU Bidan2

1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China;2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China

[Abstract]The cerebral ischemia model of middle cerebral artery occlusion in rats prepared by suture- occluded method is widely used in China because it does not require craniotomy and has the characteristics of relatively stable infarct volume，high repeatability and strong operability. This model is recognized as one of the most ideal models of the standard animal model of focal cerebral ischemia. Combining with practical experience and previous literature reports，the author shared the experience in preparing the cerebral ischemia model of middle cerebral artery occlusion in rats from the aspects of rat selection，model preparation，analysis and treatment of postoperative death and complications. The survival rate of rats after operation was improved by continuously improving the operation methods，timely and effectively treating the related symptoms caused by postoperative complications.

[Key words]Suture-occluded method;Middle cerebral artery occlusion;Cerebral ischemia;Animal model;Rat

腦卒中是一種致殘率和病死率均較高的急性腦血管疾病，分為缺血性卒中和出血性卒中，前者的發(fā)病率顯著高于后者，約占腦卒中的70%[1]。為更好地研究缺血性卒中的發(fā)病機(jī)制，評(píng)估各種干預(yù)手段和治療方法的療效，制作最接近于人類缺血性腦卒中的理想動(dòng)物模型一直是研究者們密切關(guān)注的領(lǐng)域。目前，常用的局灶性腦缺血模型的制備方法主要包括電凝法、線栓法、血栓栓塞法、光化學(xué)栓塞法等[2]，其中線栓法制備的大腦中動(dòng)脈閉塞腦缺血（MCAO）模型使用最為廣泛，已應(yīng)用于40%以上的神經(jīng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)[3]。筆者實(shí)驗(yàn)過程中總共制備248只模型大鼠，結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，從以下幾個(gè)方面分享線栓法制備MCAO模型的體會(huì)。

1??? 實(shí)驗(yàn)大鼠的選擇

1.1??? 品種與性別

大鼠是腦缺血模型經(jīng)常選用的實(shí)驗(yàn)品種，常見的品種包括Wistar大鼠、Fischer-344大鼠、Sprague-Dawley（SD）大鼠等。從血管解剖而言，Wistar大鼠由于大腦中動(dòng)脈近側(cè)大腦主動(dòng)脈分支數(shù)量較多，因此其腦梗死面積變異性相對(duì)較大、腦血管變異發(fā)生率相對(duì)較高[4]。Fischer-344大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）扭曲不適宜線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞模型，且其蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生率遠(yuǎn)高于Wistar大鼠和SD大鼠[5]。SD大鼠大腦中動(dòng)脈的變異性較小，與人類的腦血管構(gòu)成更為相似，梗死灶具有相對(duì)均一性[6]。

大鼠的性別對(duì)MCAO模型制備也存在一定影響，與雌激素對(duì)腦缺血的保護(hù)作用相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)雌激素可能通過抗氧化作用、增加腦血流量、阻滯興奮性毒性損傷等機(jī)制發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用[7]。因此筆者考慮血管解剖結(jié)構(gòu)、雌激素影響，綜合鼠源、價(jià)格等因素，選用SD雄性大鼠用以線栓法制備MCAO模型。

1.2 ???體重與月齡

SD大鼠的體重與血管的粗細(xì)相關(guān)，在體重<220 g時(shí)，血管相對(duì)較細(xì)，在制備模型過程中其對(duì)麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷的耐受性較差，術(shù)中和術(shù)后的死亡率增高;體重>350 g時(shí)，其血管相對(duì)較粗，插入的線栓可能無法充分阻塞大腦中動(dòng)脈，從而降低造模的成功率[8]。結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，筆者造模時(shí)選用的多為體重270～300 g的大鼠，造模效果較為滿意。同時(shí)大鼠的鼠齡也是影響因素之一，當(dāng)鼠齡過小或過大，其對(duì)麻醉藥物和手術(shù)操作的耐受性會(huì)變差，從而影響造模的成功率[9]。因此，筆者選取2～3個(gè)月齡的大鼠用于線栓法制備該模型。

2??? 模型制備

2.1??? 手術(shù)操作與線栓的插入方式

根據(jù)線栓的插入方式分為傳統(tǒng)的頸總動(dòng)脈插線法和改良的頸外動(dòng)脈插線法[10]。二者的主要差別在于線栓插入的部位，前者由頸總動(dòng)脈切口插入，而后者由頸外動(dòng)脈切口插入，二者各有優(yōu)勢。相比頸總動(dòng)脈插線法而言，由頸外動(dòng)脈經(jīng)頸總動(dòng)脈分叉處插入線栓的操作難度更大，操作者難以控制線栓的走向和深度，更易誤插損傷翼腭動(dòng)脈，對(duì)操作者的熟練度和解剖知識(shí)的要求更高。

綜上，筆者選取頸總動(dòng)脈插線法，見圖1。大鼠麻醉后，固定頭部和四肢，以仰臥位放置于操作臺(tái)上。仔細(xì)消毒后，持手術(shù)刀片沿頸部正中做一長約2 cm的切口。隨后從兩側(cè)頜下腺之間剪開淺筋膜，暴露左側(cè)胸鎖乳突肌，反復(fù)鈍性分離其與胸骨舌骨肌間的肌間隙，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉所在之處，該操作過程應(yīng)避免損傷氣管和胸鎖乳突肌等組織。然后沿左側(cè)頸總動(dòng)脈分叉處向心臟方向分離頸總動(dòng)脈（CCA），并對(duì)其伴行的迷走神經(jīng)行鈍性分離操作。筆者通過大量造模發(fā)現(xiàn)大鼠的迷走神經(jīng)走行存在個(gè)體差異，可使用無齒的顯微彎鑷反復(fù)輕柔地鈍性分離，能在一定程度上避免損傷迷走神經(jīng)。并且CCA分離的長度不宜過短，否則之后易致線栓頭滑出，增加操作難度。分離完迷走神經(jīng)后，在CCA 深面放置兩根細(xì)線，其中一根置于靠近CCA分叉處，打活結(jié)用以隨后固定線栓，另一根細(xì)線于CCA 的近心端結(jié)扎。隨后分離頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），用一條細(xì)線結(jié)扎ECA，另預(yù)備一條細(xì)線于ICA處，并用血管夾夾閉ICA。之后使用眼科剪在CCA上剪一“V”型小口，插入線栓頭，將CCA分叉處的活結(jié)系緊，松緊程度以能移動(dòng)線栓和松開血管夾無血液流出為度。松開血管夾的同時(shí)，迅速將線栓沿著ICA插入，阻塞大腦中動(dòng)脈（MCA）。若線栓進(jìn)入部分后出現(xiàn)阻力感，提示可能插入翼腭動(dòng)脈（PPA）[11]。此時(shí)切忌繼續(xù)用力插入，而應(yīng)將線栓稍往后退，順血管走行調(diào)整角度，避免插入PPA。順利插入線栓后，將CCA分叉處的活結(jié)再次系緊以固定線栓，并結(jié)扎ICA處預(yù)備的細(xì)線。此過程應(yīng)注意檢查CCA、ECA均結(jié)扎完畢后再行下一步操作，避免因忘記結(jié)扎或未結(jié)扎緊血管，使得血液返流，導(dǎo)致術(shù)中出血過多，影響術(shù)后生存率。若出現(xiàn)術(shù)中出血，應(yīng)保持冷靜，迅速找到出血點(diǎn)，用血管夾夾閉，待止血后，再用生理鹽水反復(fù)沖洗，保持手術(shù)視野相對(duì)清晰。若不做腦缺血再灌注模型，可剪斷殘留于外的線栓?？p合肌肉與皮膚，完成操作。

2.2??? 線栓的選擇與插入的深度

線栓的制作材料、頭端直徑、線頭的包被和形態(tài)都會(huì)影響模型制備的效果[12]，因此應(yīng)統(tǒng)一規(guī)格，盡量減少對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響。筆者使用的線栓購自北京西濃科技有限公司，選用2838A5系列型號(hào)0.38 mm栓線，該系列多適用于280～330 g體重的大鼠，栓線的長度為45 mm，頭端直徑（0.38±0.02）mm。使用該栓線制備的MCAO模型具有梗死面積相對(duì)穩(wěn)定、癥狀較重的特點(diǎn)，適用于短時(shí)間的急性期研究。筆者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用該栓線能縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、提高模型成功率、且腦梗死面積相對(duì)均一，符合模型制備的需求。

造模過程的核心環(huán)節(jié)為插入線栓，而線栓的插入深度是決定造模是否成功的關(guān)鍵。綜合國內(nèi)大多文獻(xiàn)，對(duì)于體重250～300 g的大鼠，以超過頸總動(dòng)脈分叉處18～20 mm為較為適宜的線栓插入深度，稍有阻力感即止。胡華等[13]認(rèn)為當(dāng)線栓插入深度為10～15 mm時(shí)，大鼠無明顯的神經(jīng)功能缺損;線栓插入深度為18～22 mm時(shí)，存在明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀;而線栓插入深度>22 mm時(shí)，大鼠極易昏迷不醒。筆者在操作中發(fā)現(xiàn)，插入線栓的深度以超過頸總動(dòng)脈分叉處18～19 mm為宜，而2838A5系列型號(hào)栓線的黑色標(biāo)記處距線頭為19～20 mm（±0.5 mm），故黑色標(biāo)記進(jìn)入頸總動(dòng)脈分叉附近即停止插入。

3??? 術(shù)后死亡、并發(fā)癥發(fā)生的原因分析與處理

3.1??? 死亡原因分析

筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，第一批總共造模104只大鼠，死亡31只，死亡率為29.81%。其中造模手術(shù)當(dāng)天死亡的大鼠為9只，占死亡總數(shù)的29.03%;術(shù)后第1～3天死亡的大鼠為13只，占死亡總數(shù)的41.94%。由此可知，MCAO模型的大鼠出現(xiàn)死亡的高峰期在術(shù)后的前3 d。分析其原因，蛛網(wǎng)膜下腔出血死亡的大鼠10只，繼發(fā)性腦水腫6只，失血性休克、窒息各3只，麻藥過量、營養(yǎng)不良各2只，未查明死因5只，見表1。①蛛網(wǎng)膜下腔出血：是最常見的死亡原因。操作者插入線栓的深度過深，插入線栓時(shí)力度過猛，均可導(dǎo)致蛛網(wǎng)膜下腔出血，因此要求操作者在線栓插入的操作過程中手法一定要輕柔，嚴(yán)格把握線栓的插入深度;②繼發(fā)性腦水腫：也是常見的死亡原因之一。當(dāng)大腦中動(dòng)脈阻塞后，腦組織處于急性缺血缺氧的狀態(tài)，血腦屏障遭到破壞，毛細(xì)血管通透性增加，致使水分子大量外滲，發(fā)生腦水腫[14-15];③失血性休克：術(shù)中操作失誤，手術(shù)時(shí)間過長，可導(dǎo)致大鼠術(shù)中失血過多，發(fā)生失血性休克而亡。筆者在實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)，剪頸總動(dòng)脈切口前，檢查并確保頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈結(jié)扎固定到位，操作中避免反復(fù)多次插入線栓，可有效降低術(shù)中出血風(fēng)險(xiǎn);④窒息：術(shù)中若不慎損傷氣管或迷走神經(jīng)，可導(dǎo)致呼吸抑制，呼吸道產(chǎn)生大量的分泌物而致窒息。操作時(shí)避開氣管，將迷走神經(jīng)完好分離，可有效避免大鼠因窒息而亡;⑤麻藥過量：大鼠對(duì)麻藥的敏感性和耐受性具有個(gè)體差異，麻藥過量也會(huì)致使大鼠術(shù)后無法蘇醒。故筆者實(shí)驗(yàn)時(shí)在麻醉前進(jìn)行稱重，并嚴(yán)格根據(jù)大鼠的體重予以10%的水合氯醛按照3～4 ml/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射;⑥營養(yǎng)不良：因術(shù)后營養(yǎng)不良死亡的大鼠多發(fā)生在術(shù)后1周以上，可采用10%葡萄糖按10 ml/kg劑量灌胃，1次/d。

經(jīng)過上述改進(jìn)后，在接下來的實(shí)驗(yàn)中共造模大鼠144只，死亡23只，死亡率下降至15.97%。其中蛛網(wǎng)膜下腔出血7只，繼發(fā)性腦水腫5只，失血性休克、窒息各2只，麻藥過量、營養(yǎng)不良各1只，死因不明5只。見表1。存活率第一批大鼠為70.19%，第二批大鼠為84.03%，兩批大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3.2??? 并發(fā)癥發(fā)生原因分析及處理

在實(shí)驗(yàn)過程中，248只大鼠出現(xiàn)并發(fā)癥的共70只，占造?？倲?shù)的28.23%。其中出現(xiàn)腹瀉的大鼠為41只，發(fā)生率為16.53%;陰莖水腫14只，發(fā)生率為5.65%;眼睛充血紅腫32只，發(fā)生率為12.90%;繼發(fā)性癲癇7只，發(fā)生率為2.82%。①腹瀉：其原因一是腹腔注射水合氯醛對(duì)大鼠的胃腸黏膜有刺激作用;二是腦缺血后引起胃腸黏膜缺血。對(duì)于腹瀉大鼠，應(yīng)立即予以絡(luò)合碘及生理鹽水抹洗大鼠肛周，同時(shí)勤換墊料，保持干凈的飼養(yǎng)環(huán)境。②陰莖水腫：可予以生理鹽水反復(fù)沖洗大鼠的生殖器周圍，保持生殖器清潔。③眼睛充血紅腫：部分大鼠造模成功后，會(huì)出現(xiàn)眼部充血紅腫，眼眵增多等癥狀?？赡苁且?yàn)榫€栓在插入過程中誤入翼腭動(dòng)脈引起的。筆者予以生理鹽水清理眼部，并使用紅霉素軟膏涂抹眼周，1～3次/d，有效地改善了眼部相關(guān)癥狀。④術(shù)后護(hù)理：為減少感染的發(fā)生率，術(shù)后可預(yù)防性使用青霉素注射液，在大鼠大腿肌肉豐厚處行肌內(nèi)注射。并使用生理鹽水和絡(luò)合碘清理大鼠頸部手術(shù)切口縫合處，取少量青霉素粉涂抹。另外術(shù)后大鼠體溫較低，可將其放置于保溫箱直至蘇醒，蘇醒后放置于維溫22～25℃的動(dòng)物飼養(yǎng)房內(nèi)單籠飼養(yǎng)，避免其他大鼠擠壓和踩踏影響傷口愈合，減少術(shù)后縫合傷口的感染率。采取以上措施能夠有效改善模型大鼠并發(fā)癥發(fā)生所帶來的癥狀，提高大鼠的術(shù)后存活率。

4??? 總結(jié)與體會(huì)

提高大鼠MCAO模型的存活率一直備受關(guān)注。線栓法制備大鼠MCAO模型不需要開顱，能避免開顱所帶來的一系列風(fēng)險(xiǎn)和損傷;且操作者可根據(jù)課題實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)定線栓的插入深度、線栓取出與否以及線栓的保留時(shí)間，也方便腦缺血再灌注模型的建立。它同時(shí)具備梗死面積相對(duì)穩(wěn)定、可重復(fù)性高、可操作性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此是較為常用的方法。但因模型制備過程中諸多因素可造成大鼠的死亡或引發(fā)并發(fā)癥而影響研究的開展，故筆者將實(shí)驗(yàn)過程中提升大鼠存活率、改善并發(fā)癥的經(jīng)驗(yàn)予以分享，以期為科研工作的順利進(jìn)行提供參考。

[參考文獻(xiàn)]

[1]藺文娟，吳松笛.IncRNA與缺血性腦卒中相關(guān)分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2020，37 （8）：756-759.

[2] TrotmanLucas Melissa，Gibson Claire L. A review of experimental models of focal cerebral ischemia focusing on the middle cerebral artery occlusion model[J].F1000 Research，2021，10：242.

[3] Ma R，Xie Q，Li Y，et al.Animal models of cerebral ischemia：A review[J].Biomedicine & Pharmacotherapy，2020，131：110686.

[4]王琮，陳宇，張阿龍，等.局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭谱鞣椒ㄑ芯窟M(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2021，42 （6）：506-509.

[5] Dittmar MS，Vatankhah B，F(xiàn)ehm NP，et al. Fischer-344 rats are unsuitable for the MCAO filament model due to their cerebrovascular anatomy[J].Journal of Neuroscience Methods，2006，156（1-2）：50-54.

[6]林軍，李艷芳，李沖，等.線栓法大鼠MCAO模型制作的要點(diǎn)及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（17）：3398-3402，3408.

[7]任北大，程發(fā)峰，王雪茜，等.雌激素對(duì)缺血性腦卒中的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25（2）：215-221，226.

[8]袁洪霞，朱世杰，石國鳳，等.線栓法大鼠局灶性腦缺血模型制備研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2019，35 （5）：677-678.

[9]俞璐，曹曉華，趙政，等.線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈腦缺血模型的改進(jìn)與經(jīng)驗(yàn)探討[J].神經(jīng)損傷與功能重建，2018，13 （2）：79-81.

[10]王文秀，張普，劉倩，等.改良線栓法與傳統(tǒng)線栓法制備MCAO大鼠模型20天存活率的比較[J].西部中醫(yī)藥，2020，33 （4）：42-44.

[11]馬雁鴻，蔣佳，劉蕾，等.線栓法制備MCAO大鼠模型過程中相關(guān)影響因素探析[J].遼寧中醫(yī)雜志，2020，47（4）：186-188.

[12]潘洲佳，顧佳楠，謝竹青，等.腦缺血再灌注模型制作方法的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2019，25 （14）：2801-2805.

[13]胡華，劉杰，張燕輝，等.線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈梗死模型的體會(huì)與造模失敗原因分析[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2018，16（10）：1359-1361.

[14]張立娜，陳麗霞.缺血性腦水腫分子機(jī)制及腦水腫監(jiān)測研究現(xiàn)狀[J].卒中與神經(jīng)疾病，2020 ，27 （4）：546-548.

[15] 丁小軍，楊宏，周翠翠，等.高頻超聲聯(lián)合磁敏感成像診斷早產(chǎn)兒腦損傷的臨床價(jià)值[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2021，28（13）：152-155.