2%氧濃度下H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的優(yōu)化※

宮佰會，馬春秀，寇毅英，李永芳*

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

以往利用2%氧濃度下的H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型所得研究結(jié)果備受質(zhì)疑，可能與研究模型未考慮高原條件有關(guān)。本研究擬選用三氣培養(yǎng)箱，摸索、建立高原環(huán)境下最佳培養(yǎng)條件，擬解決在高原環(huán)境下，以往研究模型可重復(fù)性差、穩(wěn)定性差、可控性差的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞

細(xì)胞H9C2(2-1)大鼠心肌細(xì)胞株，武漢普諾賽生命科技有限公司，批號CL-0089。

1.1.2 實驗試劑

DMEM培養(yǎng)基，武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WH01132012SP02；0.25%胰蛋白酶-EDTA，北京索萊寶生物科技有限公司，批號：20200728；胎牛血清，依科賽生物技術(shù)有限公司，批號：111360；雙鏈霉素，北京索萊寶生物科技有限公司，批號：20200429；CCK-8細(xì)胞活性試劑盒，Elabscience公司，批號：E-CK-A362；1×PBS無菌磷酸鹽緩沖液，北京索萊寶生物科技有限公司，批號：20201219；乳酸脫氫酶LDH試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20201225。

1.1.3 實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱，上海力康公司；H100移動式三氣培養(yǎng)箱，上海力康公司；倒置顯微鏡，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取H9C2(2-1)細(xì)胞株，觀察細(xì)胞形態(tài)是否異常，若無異常，于常氧培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中適應(yīng)環(huán)境并等待細(xì)胞貼壁，棄上清液并用無菌PBS清洗三遍，將消化細(xì)胞放在常氧培養(yǎng)箱中，1 min后取出細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)變圓且漂浮量較大的情況時置超凈工作臺，用含1%雙抗、10%FBS培養(yǎng)基終止消化并吹打均勻，更換新的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)，待處于對數(shù)生長期時進(jìn)行實驗。

1.2.2 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型建立

待H9C2細(xì)胞生長到對數(shù)生長期時消化并計數(shù)，將含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM按一定比例進(jìn)行稀釋并接種到96孔板上，置其于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)培養(yǎng)24 h后分組：正常組(N組)和模型組(M組)。正常組置常氧培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)培養(yǎng)，模型組置三氣培養(yǎng)箱(2%O2)培養(yǎng)，待培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)氣體濃度達(dá)到缺氧條件時開始計時，M1、M2、M3、M4、M5組缺氧時間分別為4、6、8、10、12 h，復(fù)氧時間均為4 h[1]，將37 ℃、5%CO2作為復(fù)氧條件。考察2%氧濃度和不同缺氧時間下的心肌細(xì)胞形態(tài)變化情況、心肌細(xì)胞存活率和LDH活性。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

按“1.2.2”項下所述方法造模，造模成功后于倒置顯微鏡(200×)下觀察細(xì)胞狀態(tài)(細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、死細(xì)胞數(shù)量)。

1.2.4 細(xì)胞存活率檢測

用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。心肌細(xì)胞分組同“1.2.2”項，另設(shè)空白組(只加空白培養(yǎng)基，不接種細(xì)胞)，每組設(shè) 6 個復(fù)孔。復(fù)氧結(jié)束后，配置CCK-8溶液(按總體積的10%)并孵育(37℃，1h)，用酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度值(A)。

計算細(xì)胞存活率(%)：(模型組-空白組)/(陰性對照組-空白組)×100%。

1.2.5 細(xì)胞LDH活性測定

心肌細(xì)胞分組同“1.2.2”項，復(fù)氧結(jié)束后，每孔吸出細(xì)胞上清液作為待測樣品。按試劑盒要求加入相應(yīng)試劑測定450 nm處吸光度值(A)。

1.2.6 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在確定模型復(fù)制方法為三氣培養(yǎng)箱法后，為優(yōu)化模型細(xì)胞培養(yǎng)條件，采用正交試驗設(shè)計法，以缺氧時間(A)/復(fù)氧4 h、空白血清比例(B)[2]、含糖量(C)為考察因素，設(shè)計L9(33)正交試驗因素水平表(表1)，對影響缺氧/復(fù)氧模型復(fù)制的條件進(jìn)行優(yōu)化。對H9C2心肌細(xì)胞計數(shù)并分為9組實驗，將細(xì)胞存活率和LDH作為模型優(yōu)化指標(biāo)。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor levels of orthogonal test

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 缺氧/復(fù)氧的細(xì)胞形態(tài)變化情況

與正常組比較，缺氧4h/復(fù)氧4h時，細(xì)胞壁清晰，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒物增多，心肌細(xì)胞死亡極少；缺氧6h/復(fù)氧4h時，細(xì)胞壁出現(xiàn)破損，心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生輕微改變；缺氧8h/復(fù)氧4h時，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒物近一步增多，大多數(shù)心肌細(xì)胞形狀變得短粗，細(xì)胞壁破損明顯；缺氧10h/復(fù)氧4h時，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞存活量少；缺氧12h/復(fù)氧4h時，細(xì)胞壁形狀不規(guī)則者增加，細(xì)胞數(shù)量減少顯著，死細(xì)胞數(shù)量顯著增加，損傷進(jìn)一步加重。(圖1)

圖1 H9C2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化圖(200×)Figure 1 Morphological changes of H9C2 cardiomyocytes(200×)

2.2 2%氧濃度及缺氧/復(fù)氧時間對H9C2心肌細(xì)胞存活率的影響情況

與正常組比較，缺氧4h/復(fù)氧4h、缺氧6h/復(fù)氧4h、缺氧8h/復(fù)氧4h、缺氧10h/復(fù)氧4h、缺氧12h/復(fù)氧4h組心肌細(xì)胞存活率隨缺氧時間延長逐漸下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異。(P<0.05)(表2)

表2 不同缺氧/復(fù)氧時間對H9C2細(xì)胞存活率的影響結(jié)果Table 2 Effects of different hypoxia / reoxygenation times on the viability of H9C2

2.3 不同時間缺氧/復(fù)氧4 h對H9C2心肌細(xì)胞LDH的影響情況

與正常組比較，缺氧/復(fù)氧各組LDH活性明顯升高(P<0.05)，且隨著缺氧時間的延長，LDH活性升高越明顯。(表3)

表3 不同時間缺氧/復(fù)氧4h對細(xì)胞LDH活性的影響Table 3 Effect of hypoxia at different time and reoxygenation for 4h on LDH

2.4 模型培養(yǎng)優(yōu)化結(jié)果

正交試驗結(jié)果從極差值(Rj)來看，缺氧時間(A因素)/復(fù)氧4h和血清比例(B因素)對模型優(yōu)化的影響最大，含糖量(C因素)次之。細(xì)胞存活率正交試驗中缺氧時間F=26.183，P<0.05，血清F=27.887，P<0.05，含糖量F=0.963，P=0.391；細(xì)胞LDH正交試驗中含糖量F=103.115，P<0.05，缺氧時間F=1.467，P=0.243，血清F=1.545，P=0.226。以細(xì)胞存活率和LDH初步判定：H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的優(yōu)化培養(yǎng)條件為缺氧8h/復(fù)氧4h、無糖、20%血清。(表4～5)

表4 細(xì)胞存活率正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of cell

表5 細(xì)胞存活率正交試驗結(jié)果乳酸脫氫酶正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal test of lactate

3 討論

H9C2細(xì)胞株是從大鼠胚胎心肌細(xì)胞分離得到的，可穩(wěn)定傳代并保持遺傳信息不變，在心臟損傷后可保有增殖能力，易于存活和培養(yǎng)，是心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型常用的心肌細(xì)胞株之一。缺氧/復(fù)氧模型常用的制備方法有化學(xué)法和物理法。其中，化學(xué)法包括二亞硫酸鈉(Na2S2O4)耗氧法、氯化鈷(CoCl2)培養(yǎng)法；物理法包括三氣培養(yǎng)箱法、厭氧箱法、厭氧罐法、低氧/厭氧工作站法、液體石蠟封閉法、安寧包厭氧法?；瘜W(xué)法的弊端在于穩(wěn)定性不好，且有毒，并且需要摸索化學(xué)試劑的用量和作用時間。液體石蠟法和安寧包厭氧法的弊端在于不容易控制氧氣的濃度。厭氧箱、厭氧罐法和低氧/厭氧工作站法的弊端在于厭氧產(chǎn)氣袋模型組的細(xì)胞存活率和LDH活性均不隨時間呈規(guī)律性變化，系統(tǒng)達(dá)到預(yù)定氣體濃度所需時間較長，密閉性能也不如三氣培養(yǎng)箱法，難以較長時間保持培養(yǎng)環(huán)境氣體的穩(wěn)定性[3]。

CCK-8法是一種測定細(xì)胞存活率的比色方法，可對其受損程度進(jìn)行評估。LDH是細(xì)胞代謝、能量傳遞、免疫調(diào)節(jié)的重要物質(zhì)，其主要存在于心肌細(xì)胞漿和心肌組織中，當(dāng)心肌細(xì)胞受到外界影響時，LDH釋放量增加，血清或細(xì)胞培養(yǎng)基活性增高，可作為診斷心肌細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物。從形態(tài)變化發(fā)現(xiàn)，在缺氧時間增加、復(fù)氧時間不變的條件下，心肌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒物不斷增加，心肌細(xì)胞壁的損傷程度逐漸加重，心肌細(xì)胞外形結(jié)構(gòu)不斷皺縮，死亡心肌細(xì)胞數(shù)量不斷增加。細(xì)胞存活率和LDH結(jié)果顯示，在2%氧氣濃度下，H9C2細(xì)胞缺氧4h/復(fù)氧4h、缺氧6h/復(fù)氧4h、缺氧8h/復(fù)氧4h、缺氧10h/復(fù)氧4h、缺氧12h/復(fù)氧4h均可引起心肌損傷(細(xì)胞存活率下降、LDH活性升高、心肌細(xì)胞形態(tài)變化等)，且隨缺氧時間的增加，細(xì)胞存活率下降、LDH釋放量增多更明顯，心肌損傷逐漸加重。說明這幾種制備方法均可創(chuàng)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型。

為了建立穩(wěn)定性、可控性、可重復(fù)性較好的細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，本課題采用正交試驗法，從多個方面進(jìn)行考慮和實驗，排除單一因素對缺氧/復(fù)氧實驗的干擾，將多種影響因素綜合分析，選出最佳的實驗方案。本實驗對大鼠血清和有關(guān)培養(yǎng)基的含糖量進(jìn)行了篩選，通過正交試驗設(shè)計法對三氣培養(yǎng)箱法建立的相關(guān)模型條件進(jìn)行了摸索、優(yōu)化，選擇以細(xì)胞存活率和LDH為判定指標(biāo)來確定模型優(yōu)化條件。從正交試驗的結(jié)果來看，隨缺氧時間的延長和血清濃度的上升，細(xì)胞存活率逐步上升，細(xì)胞活力在缺氧8h/復(fù)氧4h和缺氧10h/復(fù)氧4h時最低；但隨著含糖量和血清比例的改變，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)一定的波動；時間和血清對模型復(fù)制的影響最大，含糖量次之。在LDH的結(jié)果中，隨細(xì)胞缺氧時間延長，LDH呈現(xiàn)波動式改變。在綜合分析細(xì)胞存活率和LDH時發(fā)現(xiàn)，在6 h時，LDH的上升可能是由于細(xì)胞生長空間達(dá)到負(fù)荷而導(dǎo)致細(xì)胞生長性死亡；在8 h時，由于細(xì)胞在15%低糖缺氧狀態(tài)下仍然能夠正常生長致LDH釋放較少，在20%無糖缺氧狀態(tài)下，由于發(fā)生損傷致LDH釋放量增大，在25%高糖缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞因無太大損傷致LDH釋放量較低；在10 h時，在15%無糖缺氧狀態(tài)下，由于細(xì)胞存活率低并且隨缺氧時間的延長和血清濃度的降低造成細(xì)胞LDH釋放量增加，對細(xì)胞造成的傷害更加嚴(yán)重，20%高糖缺氧的細(xì)胞存活率較高、LDH釋放率較低，對細(xì)胞造成的傷害不明顯，25%低糖缺氧的細(xì)胞存活率較高、LDH釋放率較低，原因可能是25%血清對細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧中的損傷有一定的緩解作用，降低了其在缺氧/復(fù)氧中的損傷程度。綜合判斷，缺氧時間和大鼠空白血清濃度是缺氧/復(fù)氧模型建立過程中最大的影響因素，同時糖分的缺失會加速心肌細(xì)胞損傷。但隨缺氧時間延長，細(xì)胞會逐步適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境，活力回升，消耗營養(yǎng)物質(zhì)增多，不利于模型的建立。因此，優(yōu)化的缺氧/復(fù)氧模型條件為20%大鼠空白血清、無糖培養(yǎng)基、缺氧(2%氧濃度)8 h；正常培養(yǎng)基、常氧(21%氧濃度)4 h。

綜上所述，優(yōu)化的2%氧濃度下H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的穩(wěn)定性、可控性、重復(fù)性較好，但也存在不足，僅考慮了培養(yǎng)基中含糖量、缺氧時間及大鼠空白血清等因素對模型的影響，未充分考慮三氣培養(yǎng)箱中不同氧氣濃度對細(xì)胞缺氧造成的損傷和不同復(fù)氧時間對細(xì)胞造成的損傷。