高產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶放線菌的篩選、鑒定及酶活測定

申術(shù)霞 孟慶偉 劉金璽 任彥慧

摘要：從含廢棄物土壤中分離篩選出一株同時產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的放線菌，并對其產(chǎn)酶活力進(jìn)行測定，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對篩選菌株進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果表明，篩選出的高產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的菌株GT-B-S001為嗜熱一氧化碳鏈霉菌，該菌株產(chǎn)蛋白酶活力為161.3U/毫升、產(chǎn)纖維素酶活力為135.5U/亳升。GT-B-S001有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力，具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：蛋白酶；纖維素酶；嗜熱一氧化碳鏈霉菌；酶活力

近年來，伴隨社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口增長，人們對糧食數(shù)量和質(zhì)量的高度追求，農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物也隨之大量產(chǎn)生。在大量生成的農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物中，占首位的是農(nóng)業(yè)秸稈，其次為畜禽糞便。這些都制約了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，惡化了人類與大自然的和諧關(guān)系，而解決這一問題的根本途徑是開展農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的資源化利用。

農(nóng)用微生物正適應(yīng)了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求，利用微生物對有機(jī)廢棄物進(jìn)行處理，來治理土壤污染、改善生態(tài)環(huán)境，使有益微生物菌群回歸自然，維護(hù)好土壤、生態(tài)的健康。利用微生物對有機(jī)廢棄物進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)有機(jī)肥料又稱“堆肥”。它是指在微生物的作用下，通過高溫發(fā)酵使有機(jī)物得到分解、腐殖化和無害化的過程。在此過程中，會生成一些能被植物容易吸收利用的營養(yǎng)成分，同時合成一些能夠提高土壤肥力的新的有機(jī)物。而堆肥的研究重點是尋找產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶能力強(qiáng)的菌株（細(xì)菌、真菌、放線菌等）。本研究從土壤中分離篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶的放線菌，為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1.1 樣品

選擇常年覆蓋有農(nóng)業(yè)有機(jī)廢棄物的土壤，取樣并將其裝入滅菌后的采樣袋中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

蛋白酶篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉50.0克/升，瓊脂粉20.0克/升，113℃滅菌15分鐘。

纖維素酶篩選培養(yǎng)基：剛果紅纖維素培養(yǎng)基。高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20克/升，硝酸鉀1克/升，磷酸氫二鉀0.5克/升，硫酸鎂0.5克/升，硫酸鐵0.01克/升，氯化鈉0.5克/升，p小時7.2～7.4。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/ L）：羧甲基纖維素鈉（CMC），磷酸二氫鉀1.0克/升，氯化鈉0.1克/升，7水硫酸鎂0.3克/升，硝酸鈉2.5克/升，氯化鐵0.01克/升，氯化鈣0.1克/升，蛋白胨10.0克/升，蔗糖10.0克/升，氯化鈉5.0克/升，p小時 7.0～7.5。

1.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的分離篩選

初篩：用無菌水對采集的樣品進(jìn)行梯度稀釋，分別吸取200微升的10-3、10-4、10-4、10-6稀釋液均勻涂布于高氏一號培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48小時，挑取生長均勻的單菌落進(jìn)行純化。挑取純化后的單菌落接種于蛋白酶篩選培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48小時，觀察菌落周圍透明圈大小，挑選透明圈與菌落直徑比值較大的菌株為初篩菌株。

粗酶液的制備：初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)96小時，得到的發(fā)酵液于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘制備粗酶液，測定蛋白酶活力，選取酶活力較高的菌株為目標(biāo)菌株。

1.4 蛋白酶活力的測定

采用Folin-酚法測定蛋白酶活力。將200微升粗酶液與200微升的2%酪蛋白溶液充分混勻，于40℃溫度下反應(yīng)10分鐘后加入600微升的0.4摩爾/升的三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置10分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘制備上清液。取100微升上述制備的上清液，依次加入500微升的0.4摩爾/升的碳酸鈉溶液、100微升的福林酚試劑，充分混勻后于40℃溫度下保溫顯色20分鐘，在波長650納米下測定其吸光度。先加入三氯乙酸以終止反應(yīng)的一組作為對照組。酶活定義：在pH7.0、溫度40℃的條件下，以每分鐘水解2%酪蛋白溶液所產(chǎn)生1微克的酪氨酸酶量作為1個酶活力單位（U/毫升）。

1.5 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離篩選

將上述篩選得到的高產(chǎn)蛋白酶的菌株，經(jīng)無菌水進(jìn)行梯度稀釋后，涂布于剛果紅纖維素培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)選取挑選透明圈與菌落直徑比值較大的菌株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、200轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)96小時，得到的發(fā)酵液于12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘制備粗酶液，測定濾紙酶（FPA）活性，對菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.6 纖維素降解菌產(chǎn)酶活力測定

取一定量的粗酶液，加入含有50 毫克的CMC（或濾紙）、且pH為4.4的緩沖液中，55℃ 保溫1小時（或20分鐘），之后再加入二硝基水楊酸（DNS），沸水保溫顯色10分鐘后，冷卻至室溫，在波長550納米下測其OD值。酶活定義：將每分鐘產(chǎn)生1微摩的葡萄糖定義為一個酶活單位，用“U”表示。

1.7 高產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶菌的鑒定

菌株形態(tài)鑒定：篩選得到的菌株GT-B-S001接種于高氏一號培養(yǎng)基平板中，28℃恒溫培養(yǎng)96小時，觀察菌落形態(tài)。挑取單菌落涂片、革蘭氏染色后顯微鏡下觀測其形態(tài)特征。分子鑒定：保存的菌株 GT-B-S001兩支斜面，送農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心進(jìn)行鑒定。

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

從土壤中篩選出多株能夠產(chǎn)蛋白酶的菌株。通過比較水解圈直徑與菌落直徑的比值（R/r）和測定其蛋白酶活力，選擇R/r值為16/9的菌株GTB-S001（圖1）作為初篩菌株進(jìn)行保存，經(jīng)測定其蛋白酶活力為161.3U/毫升。

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選

將篩選所得高產(chǎn)蛋白酶菌株GT-B-S001在剛果紅纖維素培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如圖2所示，菌落周圍有透明圈出現(xiàn)，并且R/r值為13/8。經(jīng)測定該菌株產(chǎn)纖維素酶活力為135.5 U/毫升。

2.3 菌株GT-B-S001的鑒定

形態(tài)鑒定：菌株G T -B-S001在高氏一號培養(yǎng)基中，菌落顏色從最初的白色到成熟的灰色，菌落邊緣不光滑、微凸。革蘭氏陽性菌，孢子絲呈現(xiàn)直線或柔曲狀。初步判定為放線菌（圖3、圖4）。

分子鑒定：經(jīng)鑒定，菌株GT-B-S001的16 sRNA序列與鏈霉菌（Streptomyces thermocarboxydus）同源性達(dá)99%，確定菌株GT-B-S001為嗜熱一氧化碳鏈霉菌（圖5）。

試驗結(jié)果表明，篩選出的高產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的菌株GT-B-S001為嗜熱一氧化碳鏈霉菌，該菌株產(chǎn)蛋白酶活力為161.3U/毫升、產(chǎn)纖維素酶活力為135.5U/毫升。GT-B-S001有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的能力，具有較好的應(yīng)用前景。

作者簡介：申術(shù)霞（1989-），女，碩士研究生，中級工程師，研發(fā)員。主要從事微生物發(fā)酵及代謝產(chǎn)物的研究。