響應(yīng)面微波輔助酸法優(yōu)化提取西蘭花莖果膠多糖

馮李院，劉經(jīng)倫，楊梅福，艾薇，汪玉潔

（1.保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 保山 678000；2.云南省高校怒江河谷生物質(zhì)資源高值轉(zhuǎn)化與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 保山 678000）

果膠多糖是一種廣泛存在于植物初生細(xì)胞壁和胞間層中結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然高分子化合物，天然果膠類物質(zhì)主要以原果膠、果膠和果膠酸三種形態(tài)存在于植物的果實(shí)、根、莖和葉中[1-2]。其中不溶于水的原果膠在酸、堿、酶等的作用下，轉(zhuǎn)變成水溶性果膠并可通過乙醇沉淀析出，故通常以酸、堿和酶等為萃取劑和以乙醇為沉淀劑提取果膠多糖。果膠多糖具有良好的增稠性、穩(wěn)定性、凝膠性、乳化性和組織成型促進(jìn)等特性[3-9]以及具有降血糖[10-12]、調(diào)節(jié)胃腸道菌群[13-15]、抗氧化[16-17]、抗腫瘤[18-19]、免疫調(diào)節(jié)[20-21]和吸附重金屬[22-23]等作用，被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)。目前全球果膠需求量預(yù)計(jì)以每年大約3%～6%的速度遞增，而我國每年的果膠需求量有80%需要進(jìn)口，當(dāng)前商業(yè)果膠主要為柑橘皮果膠和蘋果皮果膠，我國果膠資源物產(chǎn)豐富，但很多原料副產(chǎn)物被直接丟棄或利用率不足致使果膠生產(chǎn)能力和質(zhì)量較差，若加以充分綜合利用，將會(huì)產(chǎn)生極大效益[24]。目前，果膠多糖的提取方法主要有酸提法、堿提法、酶提法、超聲波輔助法和微波輔助法等[25-26]。其中，微波是一種具有很強(qiáng)熱效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)的高頻電磁波，能使介質(zhì)材料中的分子相互摩擦碰撞，提高物料溫度和促進(jìn)提取液中細(xì)胞破裂，使原果膠多糖物質(zhì)能夠更好地滲出于提取液中。微波輔助提取技術(shù)與其他傳統(tǒng)單一的提取技術(shù)相比，具有耗時(shí)少、操作簡便和得率高等優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注。

西蘭花（Brassica oleracea L.var italic Planch）又名青花菜、西藍(lán)花、綠菜花、綠花菜等，富含硫代葡萄糖苷、多糖、維生素、礦物質(zhì)和酚類等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是一種具有多種生理功效和享有“蔬菜皇冠”美譽(yù)的蔬菜[27-28]。西蘭花原產(chǎn)于地中海東部地區(qū)，全球范圍內(nèi)均有種植，19世紀(jì)末從意大利傳入我國，根據(jù)2021年聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫顯示，從2005年至2019年間世界花椰菜和西蘭花的產(chǎn)量噸數(shù)增長54%，中國的產(chǎn)量噸數(shù)增長45%。西蘭花除花球以外的莖葉通常被當(dāng)作廢棄物大量丟棄，造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，其莖葉約占整棵植株重量的50%～70%，當(dāng)前西蘭花副產(chǎn)物主要用于發(fā)酵飼料[29]。

目前有關(guān)西蘭花莖果膠多糖提取工藝的研究較少，主要有田亞紅等[30]采用鹽酸醇沉法并通過單因素和正交試驗(yàn)得出最佳西蘭花莖葉果膠提取工藝條件，得率為0.68%（稱重法）；李妍等[31]采用超聲波結(jié)合三因素三水平響應(yīng)面得出最佳西蘭花莖多糖工藝條件，得率為5.69%（苯酚硫酸法）；Petkowicz等[32]先用乙醇預(yù)處理原料再經(jīng)硝酸乙醇沉淀法提取西蘭花莖果膠，得率為18%，同時(shí)果膠具有較好的理化性質(zhì)，可考慮作為一種商業(yè)果膠來源。

利用微波輔助酸法并結(jié)合響應(yīng)面提取西蘭花莖果膠多糖的研究尚未見報(bào)道。因此，該研究以保山當(dāng)?shù)胤N植的蔓陀綠西蘭花莖為主要原料，采用微波輔助酸法提取果膠多糖，并用單因素試驗(yàn)（料液比、提取液pH值、微波功率和微波時(shí)間）和響應(yīng)面分析法來優(yōu)化提取工藝，不僅提高西蘭花副產(chǎn)物的綜合利用率，同時(shí)也為優(yōu)質(zhì)果膠多糖來源的探究提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔓陀綠西蘭花：市售；食用酒精（經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提純后使用）：云南康豐糖業(yè)（集團(tuán)）有限公司勐糯分公司；濃鹽酸（分析純）：重慶川東集團(tuán)有限公司；95%乙醇、無水乙醇（均為分析純）：重慶川東化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱（DHG 9030A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；美的微波爐（QIMO-J1-8D）：上海琪摩電子科技有限公司；循環(huán)水式多用真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；離心機(jī)（TDL-5-A）：上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N100IDSB210）：上海泉杰儀器有限公司；超聲清洗機(jī)（SK250HP）：上?？茖?dǎo)有限公司；分析天平（CP214）：上海奧豪斯儀器有限公司；高速多功能粉碎機(jī)（CS-2000）：武義海納電器有限公司；80目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩：紹興市上虞華豐五金儀器有限公司；pH計(jì)（PHS-3C）：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 原料預(yù)處理

將新鮮蔓陀綠西蘭花除去花球、病蟲害和霉變部分，剩下的西蘭花莖（含少量葉子）洗凈切成大小和厚度大致相同的片狀，放入沸水中熱燙5 min之后用冷水沖洗（高溫滅果膠酶和纖維素酶，防止果膠多糖被降解致使果膠多糖得率降低），擠去多余水分的原料均勻攤放在瓷盤中并置于50℃烘箱烘干，粉碎過80目篩，粉末于自封袋中密封避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 提取工藝流程

稱取一定量西蘭花莖粉末，按一定料液比加入用鹽酸調(diào)pH值為設(shè)定值的純水，充分?jǐn)嚢?，測pH值后再次用鹽酸調(diào)節(jié)整個(gè)提取液pH值至目標(biāo)值。將調(diào)好pH值的提取液放入微波爐，設(shè)置一定微波功率和一段微波時(shí)間萃取后，4 500 r/min離心10 min，將上清液過濾，往濾液中加入與濾液等體積的提純工業(yè)酒精，充分?jǐn)嚢杈鶆?，用保鮮膜蓋住燒杯以防乙醇揮發(fā)，于25℃室溫靜置沉淀12 h，4 500 r/min離心20 min，將濾液通過已恒重的濾紙進(jìn)行抽濾（分別用75%、85%、95%乙醇和無水乙醇依次沖洗），棄其上清液，收集沉積物并置于空氣中以揮發(fā)掉乙醇，50℃烘箱干燥2.5 h，稱量并采用質(zhì)量法計(jì)算西蘭花莖的果膠多糖得率。

果膠多糖得率/%=（G1/G2）×100

式中：G1為成品質(zhì)量，g；G2為原料粉末質(zhì)量，g。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 料液比對果膠多糖得率的影響

固定提取液pH2.0、微波時(shí)間5.0 min和微波功率600W 條件下，考察 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）不同料液比對果膠多糖得率的影響。

1.5.2 提取液pH值對果膠多糖得率的影響

固定微波時(shí)間5.0 min、微波功率600 W和料液比1∶20，考察 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 不同提取液 pH 值對果膠多糖得率的影響。

1.5.3 微波功率對果膠多糖得率的影響

固定微波時(shí)間 5.0 min、料液比 1∶20（g/mL）和提取液 pH 值 1.5，考察 600、700、800、900、1 000 W 不同微波功率對果膠多糖得率的影響。

1.5.4 微波時(shí)間對果膠多糖得率的影響

分別取料液比1∶20（g/mL）、提取液pH值1.5和微波功率 900 W 條件下，考察 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 min 不同微波時(shí)間對果膠多糖得率的影響。

1.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以果膠多糖得率作為評價(jià)指標(biāo)的單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，利用Design-Expert V8.0.6的箱線設(shè)計(jì)（Box-Behnken design，BBD）對西蘭花莖果膠多糖提取工藝進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，具體見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of response surface test

1.7 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，標(biāo)準(zhǔn)誤差在圖中用誤差線表示；運(yùn)用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和方差分析，Origin 2018軟件和SPSS 23軟件分別進(jìn)行繪圖及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對西蘭花莖果膠多糖得率的影響

圖1為料液比對西蘭花莖果膠多糖得率的影響。

圖1 料液比對西蘭花莖果膠多糖得率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the yield of pectin polysaccharide from broccoli stalk

由圖1可知，果膠多糖得率隨著提取液的不斷增加呈先上升后下降的變化趨勢，且總體上差異顯著。其中料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，果膠多糖得率最高，為（3.83±0.10）%，與其他料液比組相比具有顯著性差異。這可能是由于提取液添加量較小時(shí)，溶液黏度大，難以保證原料中的果膠多糖完全提取到提取液中，且相對濃度過大致使過濾困難如燒杯等儀器上的果膠多糖殘留量較多，造成提取不完全，得率較低；而當(dāng)提取液添加量超過1∶20（g/mL）時(shí)，原料被過度稀釋且伴隨其他物質(zhì)的溶出，造成后續(xù)的離心、抽濾、沉淀和烘干等工藝提取不完全，致使果膠多糖的溶出率下降，同時(shí)果膠多糖在提取液添加量多時(shí)更易被水解，造成損失。因此，從得率、成本和操作性等方面考慮，擬定料液比1∶15（g/mL）～1∶25（g/mL）進(jìn)行下一步試驗(yàn)研究。

2.1.2 提取液pH值對西蘭花莖果膠多糖得率的影響圖2為提取液pH值對西蘭花莖果膠多糖得率的影響。

圖2 提取液pH值對西蘭花莖果膠多糖得率的影響Fig.2 Effects of pH value of extraction solution on the yield of pectin polysaccharide from broccoli stalk

由圖2可知，果膠多糖得率隨著提取液pH值不斷增高呈先上升后下降的變化趨勢，且總體上差異顯著。其中提取液pH值為1.5時(shí)，果膠多糖得率最高，為（4.11±0.19）%，與pH值為2.0時(shí)相比差異不顯著，而與其他pH值組相比具有顯著性差異。這可能是由于酸性條件會(huì)破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使果膠多糖溶出，但在過酸性條件下，部分果膠多糖分子會(huì)被降解成小分子量果膠多糖片段[33]，而乙醇很難將這部分小分子果膠多糖沉淀，導(dǎo)致果膠多糖得率較低；而當(dāng)提取液pH值從1.5升至3.0時(shí)，由于提取液pH值不斷升高，對植物細(xì)胞壁的破壞作用減弱，致使果膠多糖溶出量不斷減少，得率下降。因此，擬定提取液pH值1.0～2.0進(jìn)行下一步試驗(yàn)研究。

2.1.3 微波功率對西蘭花莖果膠多糖得率的影響

圖3為微波功率對西蘭花莖果膠多糖得率的影響。

圖3 微波功率對西蘭花莖果膠多糖得率的影響Fig.3 Effects of microwave power on the yield of pectin polysaccharide from broccoli stalk

由圖3可知，果膠多糖得率隨著微波功率不斷提高呈先上升后下降的變化趨勢，且總體上差異顯著。其中當(dāng)微波功率達(dá)到900 W時(shí)，果膠多糖得率最高，為（4.14±0.39）%，與微波功率800 W時(shí)相對差異不顯著，而與其他微波功率組具有顯著性差異。這可能是由于微波功率越大，對原料的穿透作用越強(qiáng)，溫度上升越快，更容易使原料中的不溶性果膠多糖轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄怨z多糖，從而果膠多糖得率升高[26]；但當(dāng)微波功率過大（超過900 W），果膠多糖水解劇烈，同時(shí)溫度過高致使果膠多糖降解，從而得率下降[34]。因此，擬定微波功率800 W～1 000 W進(jìn)行下一步研究。

2.1.4 微波時(shí)間對西蘭花莖果膠多糖得率的影響

圖4為微波時(shí)間對西蘭花莖果膠多糖得率的影響。

圖4 微波時(shí)間對西蘭花莖果膠多糖得率的影響Fig.4 Effects of microwave time on the yield of pectin polysaccharide from broccoli stalk

果膠多糖得率隨著微波時(shí)間不斷延長呈先上升后下降的變化趨勢，且總體上差異顯著。其中當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到7.0 min時(shí)，果膠多糖得率最高，為（4.60±0.21）%，與微波時(shí)間6.0 min時(shí)相比差異不顯著，而與其他微波時(shí)間組相對具有顯著性差異。這可能是由于隨著微波時(shí)間的延長，原料中的果膠多糖逐漸溶到提取液中，一些不溶性果膠多糖轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄怨z多糖；但微波時(shí)間過長（超過7.0 min），果膠多糖中的半乳糖醛酸分解加劇，從而導(dǎo)致果膠多糖得率下降[35]。因此，擬定微波時(shí)間6.0 min～8.0 min進(jìn)行下一步試驗(yàn)研究。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面方案及其結(jié)果Table 2 Response surface scheme and results

續(xù)表2 響應(yīng)面方案及其結(jié)果Continue table 2 Response surface scheme and results

2.2.2 方差分析

利用BBD對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和多項(xiàng)式擬合，得到方差分析表3和西蘭花莖果膠多糖得率的最終方程（編碼因素）。方差分析見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

西蘭花莖果膠多糖得率回歸方程：Y%=4.79+0.14X1+0.39X2+0.17X3+0.14X4+0.12X1X2-0.14X1X3+0.07X1X4-0.20X2X3-0.21X2X4-0.082X3X4-0.56X12-0.42X22-0.33X32-0.16X42。

分析表3可知，響應(yīng)面回歸模型的F值為13.7，達(dá)到極顯著水平（p＜0.000 1），表明該模型顯著；由F值大小得知，各因素對果膠多糖得率的影響大小順序?yàn)樘崛∫?pH 值（X2）＞微波功率（X3）＞料液比（X1）＞微波時(shí)間（X4），且均為顯著因素，其中提取液pH值和微波功率為極顯著因素；X2X3、X2X4和 X42為顯著因素，X12、X22、X32為極顯著因素（p＜0.000 1），說明以上顯著因素和極顯著因素與果膠多糖得率之間存在明顯的數(shù)學(xué)關(guān)系；失擬項(xiàng)不顯著（p=0.092 0＞0.05），相關(guān)系數(shù)R2=0.932 0和校正系數(shù)R2adj=0.863 9，表明該模型擬合效果良好，86.39%的果膠多糖得率變化值可通過該模型解釋，能較好地反映試驗(yàn)中4個(gè)影響因素與響應(yīng)值的變化情況[36]；變異系數(shù)為4.27%＜15%，信噪比為11.838%＞4%，表明該模型試驗(yàn)誤差小，可靠性高。

2.2.3 交互作用分析

為探究雙因素交互作用對西蘭花莖果膠多糖得率的影響，先固定4個(gè)因素中的任意兩個(gè)因素在零水平，再分析另外兩個(gè)因素的交互作用[37]，若響應(yīng)曲面坡度越陡峭，說明因素影響越大，反之影響越小[38]。

圖5為料液比與提取液pH值交互作用對果膠多糖得率的影響。

圖5 料液比與提取液pH值交互作用Fig.5 The interaction between solid-liquid ratio and pH of the extraction solution

由圖5可知，以微波時(shí)間和微波功率為定量，果膠多糖得率隨著提取液添加量或提取液pH值的增大呈先增大后減小趨勢，且變化幅度相對較小，曲面坡度較平緩，說明料液比與提取液pH值的交互作用對果膠多糖得率的影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖6為料液比與微波功率交互作用對果膠多糖得率的影響。

圖6 料液比與微波功率交互作用Fig.6 The interaction between solid-liquid ratio and microwave power

以微波時(shí)間和提取液pH值為定量，果膠多糖得率隨著提取液添加量或微波功率的增大呈先增大后緩慢減小趨勢，減小幅度小于增大幅度，曲面坡度相對于圖5稍較陡，但坡度相對于后面兩組仍較小，說明微波時(shí)間和提取液pH值的交互作用對果膠多糖得率的影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖7為料液比與微波時(shí)間交互作用對果膠多糖得率的影響。

圖7 料液比與微波時(shí)間交互作用Fig.7 The interaction between solid-liquid ratio and microwave time

以提取液pH值和微波功率為定量，果膠多糖得率隨著提取液添加量或微波時(shí)間的增大呈先增大后減小趨勢，變化幅度較小，特別是微波時(shí)間，曲面坡度較平緩，說明料液比與微波時(shí)間的交互作用對果膠多糖得率的影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖8為提取液pH值與微波功率交互作用對果膠多糖得率的影響。

圖8 提取液pH值與微波功率交互作用Fig.8 The interaction between pH of the extraction solution and microwave power

以微波時(shí)間和料液比為定量，提取液pH值或微波功率處于低水平時(shí)，果膠多糖得率隨微波功率或提取液pH值的增大呈先大幅增大后緩慢減小趨勢；而當(dāng)其逐漸處于高水平時(shí)，果膠多糖得率隨微波功率或提取液pH值的增大呈先緩慢增大后大幅減小趨勢。曲面坡度明顯陡峭，說明提取液pH值與微波功率的交互作用對果膠多糖得率的影響顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖9為提取液pH值與微波時(shí)間的交互作用對果膠多糖得率的影響。

圖9 提取液pH值與微波時(shí)間交互作用Fig.9 The interaction between pH of the extraction solution and microwave time

以料液比和微波功率為定量，當(dāng)提取液pH值或微波時(shí)間處于低水平時(shí)，果膠多糖得率隨微波時(shí)間或提取液pH值的增大呈先大幅增大后趨于平緩的趨勢；而當(dāng)其逐漸處于高水平時(shí)，果膠多糖得率隨微波時(shí)間或提取液pH值的增大呈先輕微增大后減小趨勢。曲面坡度明顯陡峭，說明提取液pH值和微波時(shí)間的交互作用對果膠多糖得率的影響顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

圖10為微波功率與微波時(shí)間交互作用對果膠多糖得率的影響。

圖10 微波功率與微波時(shí)間交互作用Fig.10 The interaction between microwave power and microwave time

以料液比與提取液pH值為定值，果膠多糖得率隨著微波功率或微波時(shí)間的增大呈先增大后減小趨勢，低水平的變化幅度大于高水平的變化幅度，但總體上變化幅度很小。曲面坡度平緩，說明微波功率與微波時(shí)間的交互作用對果膠多糖得率的影響不顯著，這與方差分析結(jié)果一致。

2.2.4 最優(yōu)參數(shù)及驗(yàn)證

響應(yīng)面得到最佳西蘭花莖果膠多糖提取工藝參數(shù)為料液比 1∶20.86（g/mL）、提取液 pH 值 1.72、微波功率907.22 W、微波時(shí)間7.14 min。為驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，結(jié)合實(shí)際條件將工藝參數(shù)修整為料液比1∶21（g/mL）、提取液pH值1.7、微波功率900 W、微波時(shí)間7.0 min。在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到西蘭花莖果膠多糖得率為（4.88±0.00）%，與預(yù)測值4.91%的相對誤差為0.94%，得率顯著高于鹽酸醇沉法（0.69%）[30]，但低于硝酸醇沉法（18%）[32]，這可能是由于不同提取方法、不同預(yù)處理和原料成分差距等原因造成，但仍可說明采用此響應(yīng)面優(yōu)化的西蘭花莖果膠多糖提取工藝具有良好的可靠性和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用微波輔助酸法提取西蘭花莖果膠多糖，分別研究料液比、提取液pH值、微波功率和微波時(shí)間4個(gè)因素對西蘭花莖果膠多糖得率的影響，以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，通過Design-Expert V8.0.6 BBD進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析出西蘭花莖果膠多糖提取的最佳工藝條件為料液比1∶21（g/mL）、提取液pH值1.7、微波功率900 W、微波時(shí)間7.0 min，在此條件下西蘭花莖果膠多糖得率為（4.88±0.00）%，與預(yù)測值僅有0.94%的相對誤差。響應(yīng)面模型顯著且擬合度高，四個(gè)因素對果膠多糖得率的影響大小順序：提取液pH值（X2）＞微波功率（X3）＞料液比（X1）＞微波時(shí)間（X4），且均為顯著因素，其中提取液pH值和微波功率為極顯著因素，編碼因素方程∶Y%=4.79+0.14X1+0.39X2+0.17X3+0.14X4+0.12X1X2-0.14X1X3+0.07X1X4-0.20X2X3-0.21X2X4-0.082X3X4-0.56X12-0.42X22-0.33X32-0.16X42。該試驗(yàn)不僅對西蘭花的副產(chǎn)物進(jìn)行綜合利用，同時(shí)為西蘭花莖果膠多糖的提取研究提供微波輔助酸法技術(shù)支持，以期為探究我國優(yōu)質(zhì)果膠來源提供有價(jià)值的理論和試驗(yàn)依據(jù)。