染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4在胰腺癌中表達(dá)的臨床與生物信息學(xué)分析

孫煒瑋，馬丹丹，董慶泰，李中虎，林振宇，金煒東，楊瑞

（中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科，湖北 武漢 430070）

目前，胰腺癌的發(fā)病率和病死率在世界范圍內(nèi)逐年上升，這意味著胰腺癌將構(gòu)成重大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[1]。由于胰腺癌早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，而腫瘤的快速發(fā)展又使得臨床上診斷為胰腺癌的患者多為中晚期，失去了治療的最佳時(shí)機(jī)，所以胰腺癌的5年生存率很低[2]。因此胰腺癌的診斷和治療形勢是嚴(yán)峻的。為了改善胰腺癌的臨床療效，研究人員試圖根據(jù)腫瘤生物學(xué)和遺傳學(xué)來制定新的治療方案[3]。因此，探索具有高敏感性和特異性的胰腺癌預(yù)后生物標(biāo)志物已成為近年來的研究熱點(diǎn)。

染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4（structural maintenance of chromosome 4，SMC4）參與維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和真核細(xì)胞的有絲分裂[4]。既往研究表明，SMC4在乳腺癌[5]、肝癌[6]、結(jié)腸癌[7]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[8]、肺 癌[9]、宮頸癌[10]等多種惡性腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要功能。但目前國內(nèi)外關(guān)于SMC4 在胰腺癌中功能、預(yù)后評估、信號通路的報(bào)道甚少，機(jī)制不明。因此，本研究基于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)明確SMC4 在胰腺癌中的mRNA表達(dá)情況，同時(shí)利用胰腺癌標(biāo)本進(jìn)一步驗(yàn)證SMC4 在胰腺癌中的蛋白表達(dá)情況。繼而利用生物信息學(xué)技術(shù)分析其表達(dá)差異與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，并探討其可能參與的信號通路。為研究胰腺癌的早期診斷、病情監(jiān)測及預(yù)后判斷提供新思路。

1 資料和方法

1.1 SMC4在胰腺癌中表達(dá)的臨床分析

1.1.1 SMC4在胰腺癌組中的蛋白表達(dá)分析：對2020年7月至2021年6月在中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院接受根治性胰十二指腸切除術(shù)治療的12例胰腺癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行分析。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blotting）檢測SMC4在胰腺癌組織及配對癌旁組織中的表達(dá)。按照總蛋白抽提試劑盒操作說明提取蛋白。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。配置分離膠和濃縮膠，取等量蛋白樣本進(jìn)行電泳分離。停止電泳，將全部蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，分別加入用封閉液稀釋的SMC4及β-actin單克隆抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，用TBST緩沖液（tris buffered saline tween）洗膜3次，每次10 min。再用封閉液稀釋二抗（1∶5 000），室溫?fù)u床孵育1h，TBST洗膜3次，每次10 min。化學(xué)發(fā)光試劑曝光檢測。蛋白條帶的灰度值通過灰度掃描儀分析獲得。

1.1.2 SMC4 在胰腺癌組織中的基因表達(dá)分析：在GEPIA（Gene Expression profiling interactive analysis）（http://gepia.cancer-pku.cn/）數(shù)據(jù)庫中設(shè)定條件為：“gene:SMC4”“expression diy:boxplot”“cancer type：

PAAD”，獲得SMC4 在胰腺癌組織與正常組織中的表達(dá)差異。納入數(shù)據(jù)資料為TCGA數(shù)據(jù)庫及GTEx數(shù)據(jù)庫，其中胰腺癌組織179例，均來自TCGA數(shù)據(jù)庫，正常胰腺組織171 例，其中4 例來自TCGA數(shù)據(jù)庫，167例來自GTEx數(shù)據(jù)庫。

1.1.3 SMC4 在胰腺癌組織中的mRNA表達(dá)分析：在TCGA下載的177例胰腺癌患者資料中，同時(shí)具有SMC4表達(dá)量數(shù)據(jù)及對應(yīng)臨床病理資料的患者共173例。以胰腺癌患者SMC4 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)為分割點(diǎn)將患者劃分SMC4 高表達(dá)組與SMC4 低表達(dá)組。采用Wilcoxon檢驗(yàn)分析SMC4在胰腺癌組織中的mRNA表達(dá)差異。

1.2 生物信息學(xué)分析

1.2.1 SMC4相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)：STRING（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)庫可根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道、數(shù)據(jù)庫收錄數(shù)據(jù)及分子間共表達(dá)蛋白相關(guān)性等證據(jù)給出蛋白質(zhì)間存在相互作用的可信度評分（score）。該分?jǐn)?shù)越接近1，分子間存在相互作用的可信度越大，分?jǐn)?shù)越接近0說明目前證據(jù)不足，可信度越低。在STRING中搜索蛋白質(zhì)名稱“SMC4”，選擇物種“Homo sapiens”，可獲取SMC4相互作用蛋白。

1.2.2 GSEA富集分析：GSEA（Gene set enrichment analysis）是基于JAVA語言的一款基因富集分析軟件，本研究利用GESA軟件進(jìn)行KEGG通路富集分析。TCGA數(shù)據(jù)庫中55 268 個(gè)基因被納入分析。每次分析進(jìn)行1 000次基因組排列。本次研究采用的基因集數(shù)據(jù)庫為“c2.cp.kegg.v7.2 symbols.gmt”。校正P值及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）均＜0.05的基因組被認(rèn)為具有顯著性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SMC4在胰腺癌中的蛋白表達(dá)差異采用配對樣本t檢驗(yàn)，SMC4 基因表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。胰腺癌患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系采用單因素及多因素Cox回歸分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SMC4在胰腺癌組織和癌旁組織中的蛋白表達(dá)差異

Western blotting檢測結(jié)果顯示SMC4在胰腺癌組織中的蛋白表達(dá)量高于癌旁組織[（1.658±0.043）vs（0.539±0.023）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=79.541，P＜0.001）。見圖

圖1 SMC4在胰腺組織中的蛋白表達(dá)情況

2.2 SMC4 mRNA在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的表達(dá)差異

對GEPIA數(shù)據(jù)庫中，179例胰腺癌組織與171例正常胰腺組織對比分析顯示，SMC4 mRNA在胰腺癌組織中的表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 SMC4在胰腺組織中的mRNA表達(dá)情況

2.3 SMC4基因表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特

征的關(guān)系

對TCGA數(shù)據(jù)庫的173例SMC4基因表達(dá)水平與胰腺癌患者的病理分級（χ2=10.005，P=0.019）和T分期（χ2=10.395，P=0.015）密切相關(guān)，與年齡、性別、病理分期、N分期、M分期無關(guān)（均P＞0.05）。見表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中SMC4基因表達(dá)水平與胰腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.4 胰腺癌臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

單因素Cox分析結(jié)果顯示SMC4 mRNA表達(dá)水平（HR1.650，95%CI1.085～2.511，P=0.019）和N分期（HR2.001，95%CI1.193～3.354，P=0.009）對胰腺癌患者的預(yù)后存在顯著影響。進(jìn)一步多因素Cox分析結(jié)果顯示SMC4 mRNA表達(dá)水平（HR1.549，95%CI1.005～2.389，P=0.047）和N分期（HR1.829，95%CI1.045～3.201，P=0.035）是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。SMC4 mRNA表達(dá)水平越高提示胰腺癌不良預(yù)后的可能性更大。見表2。

表2 Cox回歸分析TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)SMC4 mRNA表達(dá)水平的中位數(shù)將胰腺癌患者分為SMC4高表達(dá)組與SMC4低表達(dá)組。利用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線。結(jié)果表明SMC4 高表達(dá)組胰腺癌患者的中位生存時(shí)間顯著短于SMC4低表達(dá)組患者（19.73個(gè)月vs22.03個(gè)月，χ2=5.596，P=0.018），見圖3。

圖3 SMC4高表達(dá)組與SMC4低表達(dá)組胰腺癌患者的生存曲線

2.5 SMC4相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)

利用STRING數(shù)據(jù)庫分析人源SMC4 可能存在的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果表明：與SMC4相互作用Score排名前10 位的蛋白分別為NCAPH（Score=0.999）、NCAPG（Score=0.999）、SMC2（Score=0.999）、NCAPD2（Score=0.999）、NCAPD3（Score=0.999）、NCAPG2（Score=0.998）、NCAPH2（Score=0.997）、CDK1（Score=0.996）、PLK1（Score=0.991）、AURKB（Score=0.991）。見圖4。

圖4 SMC4相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.6 SMC4功能GSEA富集分析

GSEA研究結(jié)果顯示：SMC4 mRNA高表達(dá)樣本富集到ERBB信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路、Notch信號通路、VEGF信號通路、JAK STAT信號通路等相關(guān)基因集，詳見表3。且SMC4 mRNA表達(dá)水平與上述通路中的基因表達(dá)呈正相關(guān)，即當(dāng)SMC4基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，上述通路被激活。

表3 SMC4的通路富集分析

3 討論

探索具有高敏感性和特異性的胰腺癌生物標(biāo)志物是改善胰腺癌患者生存預(yù)后的關(guān)鍵措施之一[3]。SMC4在乳腺癌[5]、結(jié)直腸癌[7]、膠質(zhì)瘤[8]及肝癌[11]中高表達(dá)，參與了腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并與其不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于SMC4在胰腺癌功能及機(jī)制方面的研究甚少。

本研究基于本院臨床樣本及生物信息學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)分析了SMC4 在胰腺組織中的差異表達(dá)，并全面評估其表達(dá)差異對胰腺癌預(yù)后的診斷價(jià)值。分析結(jié)果顯示，SMC4 在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織。SMC4 高表達(dá)組胰腺癌患者的生存時(shí)間顯著低于SMC4低表達(dá)組患者，進(jìn)一步Cox回歸分析結(jié)果證實(shí)，SMC4 高表達(dá)可能是胰腺癌獨(dú)立的不良預(yù)后因子。Huang等[5]報(bào)道SMC4高表達(dá)和表皮生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）高表達(dá)水平均是導(dǎo)致三陰性乳腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，可作為輔助診斷指標(biāo)。SMC4的高表達(dá)是結(jié)直腸癌患者生存率不佳的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素[12-13]。SMC4在膠質(zhì)瘤組織中的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著高于正常腦組織，SMC4 表達(dá)升高與腫瘤進(jìn)展和膠質(zhì)瘤患者總體生存率有關(guān)，是膠質(zhì)瘤藥物治療中的一個(gè)有價(jià)值的預(yù)后因素和潛在靶點(diǎn)[8，14]?？梢奡MC4可能是胰腺癌的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因子，可為胰腺癌的早期診斷提供重要的支持證據(jù)。

SMC4 在胰腺癌中的功能不明確，Pandey等[15]報(bào)道SMC2 與SMC4 是相互作用蛋白，在瘧原蟲生命周期的非典型有絲分裂中起著關(guān)鍵作用，可能在不同的增殖階段發(fā)揮不同的功能，它們的去除或消耗會(huì)導(dǎo)致寄生蟲的發(fā)育受損，并阻止傳播。Robellet等[16]報(bào)道SMC4與CDK1相互作用增加癌細(xì)胞增殖，且SMC4 的高表達(dá)可促進(jìn)PLK1 的上調(diào)進(jìn)而增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)錄活性及相關(guān)細(xì)胞入侵。上述研究結(jié)果證實(shí)SMC4通過與相互作用蛋白SMC2、CDK1、PLK1作用發(fā)揮功能。本研究結(jié)果提示與SMC4 相互作用的蛋白還有NCAPH、NCAPG、NCAPD2、NCAPD3、NCAPG2、NCAPH2、AURKB等，可為SMC4的功能研究提供新線索。

目前，SMC4 在胰腺癌中發(fā)揮功能的具體機(jī)制不明。Huang等[5]報(bào)道當(dāng)SMC4 表達(dá)下調(diào)時(shí)，PI3K/AKT信號通路的激活失效，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移。SMC4在肝癌中表達(dá)上調(diào)，可有效促進(jìn)肝癌進(jìn)展及侵襲[6，11]。但miR-219表達(dá)水平增加可導(dǎo)致SMC4表達(dá)水平顯著下降，進(jìn)而下調(diào)JAK2/Stat3的表達(dá)，在肝癌中發(fā)揮腫瘤抑制作用。Jiang等[14]的研究結(jié)果表明過表達(dá)SMC4通過激活TGF-β/Smad信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率、遷移和侵襲能力。本研究利用GSEA富集分析預(yù)測SMC4在胰腺癌中發(fā)揮功能的可能信號通路有JAK STAT信號通路、TGF-β信號通路，與文獻(xiàn)報(bào)道[17]一致。除此之外，還預(yù)測到ERBB信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路、VEGF信號通路等，可為SMC4在胰腺癌中的機(jī)制研究提供更多線索和思路，值得進(jìn)一步探討與證實(shí)。

綜上所述，SMC4在胰腺癌中高表達(dá)，且與胰腺癌不良預(yù)后密切相關(guān)，表現(xiàn)為癌基因特性，可能在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌作用，有望成為胰腺癌診治的新靶點(diǎn)和生物學(xué)標(biāo)志物。