circ-MTHFD1L促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌進(jìn)展的作用機(jī)制

鄭堅(jiān)江，阿木提江·馬合木提，郭磊，劉躍全,張濤

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 胰腺外科，新疆 烏魯木齊 830001）

胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是一種高度致死性的癌癥，目前研究顯示PDAC患者的五年生存率低于6%[1-2]。一般來說，胰腺導(dǎo)管腺癌來源于成熟的腺泡細(xì)胞轉(zhuǎn)化為導(dǎo)管樣細(xì)胞，轉(zhuǎn)化過程稱為腺泡化生（ADM），可由致癌基因突變或胰腺炎等因素誘發(fā)[3-4]。PDAC有兩種不同的病變形式，包括導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤和胰腺上皮內(nèi)瘤變。盡管對(duì)PDAC的研究已經(jīng)開展了幾十年，但患者的治療效果和生活質(zhì)量仍然很差[5-6]。因此，深入探討PDAC的發(fā)病機(jī)制以便尋找到更好的治療靶點(diǎn)和診斷方法迫在眉睫。

30年前首次報(bào)道的環(huán)狀RNA（circRNA）是一個(gè)復(fù)雜的RNA家族[7]。既往circRNAs被認(rèn)為是由RNA的意外剪接錯(cuò)誤所產(chǎn)生，直到最近幾年，全基因組分析證實(shí)circRNA是一種新型的環(huán)狀RNA。circRNA通常有三種類型：外顯子環(huán)狀RNA、內(nèi)含子環(huán)狀RNA和基因間環(huán)狀RNA，其中以外顯子環(huán)狀RNA最常見[8-9]。目前證據(jù)表明，circRNA在多種疾病中發(fā)揮著重要作用，例如帕金森病、動(dòng)脈粥樣硬化，尤其是在癌癥中。例如，與正常結(jié)腸樣本相比，腫瘤組織中環(huán)狀RNA的比例總體下降，尤其是在結(jié)直腸癌樣本中[10]。另有研究顯示circRNA在PDAC中顯著失調(diào)[11]，circ-MTHFD1L是從MTHFD1L mRNA的chr6:151336015-151413723 位置剪接而成[11]。miR-217 作為一種與腫瘤相關(guān)的miRNA，已在非小細(xì)胞肺癌、喉癌及宮頸癌等腫瘤中進(jìn)行報(bào)道[12-14]。此外，一項(xiàng)關(guān)于非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-217 能夠通過調(diào)控E2F3 影響其腫瘤進(jìn)程[12]。這些數(shù)據(jù)表明miR-217和E2F3在腫瘤進(jìn)程中扮演重要角色。然而circ-MTHFD1L在PDAC中扮演的作用尚不明確，因此本研究試圖通過分子生物學(xué)手段深入探討circ-MTHFD1L在PDAC中作為生物標(biāo)志物的選擇及靶向療法的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本微陣列分析

GPL19978平臺(tái)數(shù)據(jù)來分析GSE79634的微陣列數(shù)據(jù)集來篩選差異表達(dá)的circRNA。微陣列數(shù)據(jù)集包括20個(gè)PDAC樣本和20個(gè)配對(duì)癌旁組織樣本。以Fold change＞2且P＜0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異表達(dá)的circRNA并用R軟件包進(jìn)行火山圖和熱圖展示。

1.2 臨床組織樣本

回顧性分析2018年1月至2019年12月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院治療的20例PDAC患者的癌組織及相應(yīng)癌旁組織樣本用于我們的研究，患者一般資料見表1。本研究方案通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20171203），所有參與患者均簽署知情同意書。癌組織和癌旁組織標(biāo)本術(shù)后立即置于液氮中長(zhǎng)時(shí)間保存。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)組織病理學(xué)活檢診斷為 PDAC；（2）術(shù)前均未接受放療和化療或其他治療；（3）患者依從性較好。

排除標(biāo)準(zhǔn)：同時(shí)患有其他惡性疾病患者。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人PDAC 細(xì)胞系，包括PANC-1、HPAC、CFPAC-1、BXPC-3 和人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7，購(gòu)自北京北納生物有限公司。其中PANC-1、HPAC和HPDE6-C7 在含有10%胎牛血清的高葡萄糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，CFPAC-1 在Iscoves改良培養(yǎng)基（IMDM）（Gibco公司，美國(guó)）中培養(yǎng)。所有細(xì)胞置于5% CO2和37 ℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.4 RNase R處理

用circ-MTHFD1L和GAPDH在20 μL反應(yīng)緩沖液在37 ℃溫度中進(jìn)行RNaseR消化反應(yīng)45 min。通過乙醇沉淀法以除去酶和鹽。以3U酶/1 μg RNA的比例重復(fù)消化和沉淀反應(yīng)兩次。用2.0% TAEAgarose凝膠電泳或2100生物分析儀（Aglient）對(duì)處理過RNA樣品進(jìn)行分析，并與未處理的RNaseR樣品進(jìn)行比較。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5 shRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建

利用RNAi干擾序列設(shè)計(jì)軟件BLOCK-iTTRNAi Designer（Invitrogen公司，美國(guó)）設(shè)計(jì)circ-MTHFD1L和E2F3 的干擾核苷酸序列，合成堿基數(shù)相同的無關(guān)核酸序列作為陰性對(duì)照。表1 顯示干擾物的相關(guān)序列。circ-MTHFD1L和E2F3上構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體，在shRNA的5’和3’端分別引入BbsI和BamHI限制性位點(diǎn)合成單鏈寡核苷酸和互補(bǔ)鏈，然后購(gòu)買pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒載體含有新霉素抗性篩選標(biāo)記并表達(dá)GFP蛋白的Gene Pharma（中國(guó)）分別與shRNA連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α經(jīng)廣泛擴(kuò)增后提取，分別命名為shRNA-circ-MTHFD1L、shRNA-E2F3和非特異性序列（shRNA-NC）。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

pcDNA3.1-circ-MTHFD1L載體（p-MTHFD1L）、pcDNA3.1 載體、shRNA-circ-MTHFD1L載體、shRNA-E2F3 載體、pGPH1/GFP/Neo質(zhì)粒載體、miR-217模擬物和miR-217抑制劑來自上海吉瑪基因公司。轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞用胰蛋白酶消化后重懸于完全培養(yǎng)基中，用移液管混合制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞在6孔板（1×106/孔）中培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，直至細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%。轉(zhuǎn)染前3 h，將原始培養(yǎng)基更換為不含血清和抗生素的新鮮基礎(chǔ)（FBS）培養(yǎng)基。使用Gene Pharma（中國(guó)）的Lipofectamine 2000按照試劑盒說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

組織樣品和細(xì)胞系中的總RNA 由TRIzol 試劑（Invitrogen，美國(guó)）按照制造商的方案制備。然后，使用Prime Script RT試劑盒（寶生物，中國(guó)）合成cDNA。MiRNA和miRNA的QRT-PCR分析使用TaqMan MicroRNA Assay Kit（Applied Biosystems，美國(guó)）和SYBR?Premix Ex Tag? Ⅱ（寶生物，中國(guó)）在ABI 7500 Real-Time上進(jìn)行PCR系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國(guó)）。PCR條件如下：95 ℃（30 s），95 ℃（5 s）和60 ℃（34 s）40個(gè)循環(huán)。GAPDH和U6作為研究的內(nèi)參基因?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究涉及的引物序列見表2。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

轉(zhuǎn)染后72 h后收集細(xì)胞，制備總蛋白后通過二辛可寧酸（CCA）蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（Beyotime Biotechnology，中國(guó)）測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。隨后，蛋白質(zhì)樣品通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美國(guó)）上，該膜在Tris緩沖鹽水和吐溫中封閉用5%脫脂奶粉浸泡2 h。接下來，將膜與兔抗一抗（1∶1 000）在4 ℃孵育過夜。之后，用TBST清洗，然后在室溫下進(jìn)行二抗孵育2 h。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量蛋白質(zhì)水平。內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.9 細(xì)胞活力檢測(cè)

采用MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞增殖水平，每個(gè)孔用含有100 μL新鮮0.5 g/L MTT的無血清培養(yǎng)基代替轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基。在37 ?C孵育4 h后，吸除MTT培養(yǎng)基，并在每孔中加入50 μL DMSO。然后在37 ℃ 孵育10 min，用微板光度計(jì)測(cè)量455 nm處的吸光度。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè)

對(duì)于侵襲和遷移測(cè)定，transwell室分別用或不用基質(zhì)膠（BD Biosciences，美國(guó)）進(jìn)行預(yù)處理。當(dāng)?shù)撞啃∈液泻現(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基時(shí)，頂部小室含有無血清培養(yǎng)基。37 ?C培養(yǎng)48 h后，用棉簽清除留在上表面的細(xì)胞。同時(shí)，將黏附在底部表面的那些用4%的甲醛固定并用0.1%的結(jié)晶紫染色以使用顯微鏡（Olympus，日本）檢測(cè)圖像。

1.11 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

將含有miR-491 靶位點(diǎn)的擴(kuò)增的TPX2 野生型或突變型3’UTR插入pMIR-GLO熒光素酶報(bào)告載體（Ambion，美國(guó)）。然后，根據(jù)制造商的方案，使用Lipofectamine? 2000（Invitrogen，美國(guó)）將TPX2基因的寬型或突變型 3’UTR的miR-491模擬物和熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Promega，美國(guó)）用于測(cè)量轉(zhuǎn)染后48 h MCF-7的熒光素酶活性。

1.12 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染48 h后，收集轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組的PDAC細(xì)胞，洗滌并懸浮。根據(jù)生產(chǎn)商的說明，使用來自BD Biosciences（San Jose，美國(guó)）的PE/Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)PDAC細(xì)胞。用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，利用FACS Diva軟件進(jìn)行分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.13 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)

shRNA-circ-MTHFD1L和pGPH1/GFP/Neo重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。大量擴(kuò)增后，提取質(zhì)粒。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人PDAC細(xì)胞PANC-1細(xì)胞制備1×107細(xì)胞/mL無血清細(xì)胞溶液，裸鼠左右皮下接種0.2 mL/鼠背部的一層，每組6只裸鼠。每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量1次腫瘤體積。第25天后處死所有裸鼠并取出腫瘤組織用于體積和重量測(cè)量。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 circ-MTHFD1L在胰腺導(dǎo)管癌中表達(dá)及預(yù)后情況

利用GPL19978 平臺(tái)對(duì)GSE79634 芯片進(jìn)行分析，通過篩選在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)了10個(gè)顯著上調(diào)和10個(gè)顯著下調(diào)的circRNA，并且circ-MTHFD1L（hascirc-104227）是胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)差異最高的circRNA（圖1A～B）。根據(jù)CircBase數(shù)據(jù)庫注釋，circ-MTHFD1L是從MTHFD1基因的chr6:151336015-151413723 剪接的，最終長(zhǎng)度為661 nt（圖1C）。利用反向引物在PANC-1細(xì)胞circ-MTHFD1L連接位點(diǎn)下游和上游擴(kuò)增circ-MTHFD1L的cDNA約100 bp，Sanger的測(cè)序結(jié)果與CircBase數(shù)據(jù)相似。用RNase R處理后，細(xì)胞中circ-MTHFD1L的含量無明顯改變，證明其環(huán)狀結(jié)構(gòu)屬性（圖1D）。進(jìn)一步qRT-PCR結(jié)果（圖1E～F）顯示，PDAC組織中circ-MTHFD1L表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且在PDAC細(xì)胞系中circ-MTHFD1L表達(dá)水平也較高，尤其是PANC-1 細(xì)胞。因此，本研究選擇PANC-1 細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞模型。此外，本研究通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)cicr-MTHFD1L 的PDAC患者的生存率低于低表達(dá)cicr-MTHFD1L的患者（P＜0.05，圖1G）。

圖1 circ-MTHFD1L在PDAC組織和細(xì)胞中表達(dá)情況

2.2 circ-MTHFD1L促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展

為了探索circ-MTHFD1L在PDAC中的作用，本研究構(gòu)建了pcDNA3.1-circ-MTHFD1L（p-MTHFD1L）和sh-circ-MTHFD1L（sh-MTHFD1L）載體以轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞（圖2A）。然后，通過qRT-PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組中circ-MTHFD1L的表達(dá)水平，結(jié)果（圖2B～C）顯示，與sh-MTHFD1L組相比，p-MTHFD1L組中circ-MTHFD1L表達(dá)顯著升高，在sh-MTHFD1L組中顯著降低。MTT測(cè)定結(jié)果（圖2D）表明circ-MTHFD1L促進(jìn)了PDAC細(xì)胞的增殖，并且當(dāng)敲除circ-MTHFD1L時(shí)，PDAC細(xì)胞的活力受到抑制。此外，流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡測(cè)定的結(jié)果（圖2E）表明circ-MTHFD1L具有降低細(xì)胞凋亡率的能力，但當(dāng)circ-MTHFD1L的表達(dá)被抑制時(shí)我們觀察到相反的現(xiàn)象。如圖2F所示，circ-MTHFD1L過表達(dá)的PDAC細(xì)胞具有很強(qiáng)的遷移和侵襲能力，而sh-MTHFD1L細(xì)胞則表現(xiàn)出相反的結(jié)果。綜上所述，circ-MTHFD1L具有促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的能力。

圖2 circ-MTHFD1L在PDAC細(xì)胞中的作用情況

2.3 敲除circ-MTHFD1L抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

為了進(jìn)一步探討circ-MTHFD1L對(duì)體內(nèi)裸鼠腫瘤發(fā)展速度的影響，將sh-MTHFD1L質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的PANC-1 細(xì)胞和陰性對(duì)照（NC）通過皮下組織注射到裸鼠體內(nèi)。經(jīng)過連續(xù)25 天的觀察，發(fā)現(xiàn)circ-MTHFD1L的敲低顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)（P＜0.01，圖3A～B）。在第25天處死所有裸鼠取出腫瘤，并測(cè)量腫瘤的重量，顯示sh-MTHFD1L組的腫瘤重量與NC組相比較小（P＜0.01，圖3C）。此外，通過qRTPCR檢測(cè)，sh-MTHFD1L組中circ-MTHFD1L的表達(dá)低于NC組（P＜0.01，圖3D）。

圖3 circ-MTHFD1L對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響

2.4 circ-MTHFD1L與miR-217的靶向關(guān)系情況驗(yàn)證

本研究通過miRbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-217可能是circ-MTHFD1L的靶基因（圖4A）。為了驗(yàn)證 circ-MTHFD1L和miR-217之間的關(guān)系，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-217 對(duì)研究野生型和突變型circ-MTHFD1L的熒光素酶活性的影響。如圖4B所示，miR-217顯著抑制了circ-MTHFD1L-WT組的熒光素酶活性。qRT-PCR結(jié)果（圖4C）顯示miR-217的表達(dá)在circ-MTHFD1L過表達(dá)的PANC-1細(xì)胞中顯著下調(diào)，但當(dāng)circ-MTHFD1L被敲低時(shí)顯著增加。然而，無論miR-217的表達(dá)水平如何，都不會(huì)影響circ-MTHFD1L的表達(dá)水平（圖4D）。

圖4 irc-MTHFD1L與miR-217的靶向關(guān)系驗(yàn)證

2.5 circ-MTHFD1L通過調(diào)控miR-217影響E2F3的表達(dá)

TargetScan 7.1數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)了miR-217和E2F3基因之間的兩個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖5A）。然后，通過雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定驗(yàn)證了PANC-1細(xì)胞中E2F3-3'UTR和miR-217 之間的靶向關(guān)系。結(jié)果表明miR-217模擬物能夠顯著抑制E2F3-WT1或E2F3-WT2的熒光素酶活性，但miR-217 模擬物和E2F3-MUT組在PANC-1 細(xì)胞中與NC組相比熒光素酶表達(dá)無明顯差異（圖5B～C）。使用蛋白質(zhì)印跡研究敲低circ-MTHFD1L和上調(diào)miR-217表達(dá)后E2F3蛋白表達(dá)水平的變化。發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-217 過表達(dá)時(shí)E2F3 蛋白表達(dá)降低，sh-circ-MTHFD1L也可以通過競(jìng)爭(zhēng)性吸附miR-217下調(diào)E2F3蛋白（P＜0.01，圖5D）。

圖5 circ-MTHFD1L和miR-217對(duì)E2F3表達(dá)的影響

2.6 miR-217通過抑制E2F3影響胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的發(fā)育

用sh-E2F3 質(zhì)粒載體和miR-217 抑制劑轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞后，將PANC-1細(xì)胞系分為4個(gè)轉(zhuǎn)染組：NC組、sh-E2F3組、miR-217抑制劑組和sh-E2F3+miR-217抑制劑組。CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sh-E2F3組PANC-1細(xì)胞增殖受抑制，而miR-217抑制劑組則促進(jìn)（P＜0.01，圖6A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示E2F3的低表達(dá)促進(jìn)了PANC-1細(xì)胞的凋亡，而miR-217抑制劑降低了PANC-1細(xì)胞的凋亡。此外，miR-217 抑制了E2F3 對(duì)PDAC細(xì)胞的影響并使PDAC細(xì)胞的凋亡恢復(fù)至正常水平（P＜0.01，圖6B-C）。Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示E2F3低表達(dá)降低細(xì)胞遷移和侵襲，但miR-217抑制劑與NC組相比增加遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)，miR-217逆轉(zhuǎn)E2F3對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響（P＜0.01，圖6D）。

圖6 miR-217通過抑制E2F3調(diào)控腫瘤進(jìn)程

3 討論

本研究探討circ-MTHFD1L、miR-217 和E2F3在PDAC中的作用及其相互作用。通過Arraystar Human circRNAs基因芯片分析并篩選出在腫瘤組織和癌旁組織差異表達(dá)的circ-MTHFD1L。此外，PDAC組織和癌旁組織的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，PDAC組織中circ-MTHFD1L的表達(dá)顯著升高。此外，TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)顯示高表達(dá)circ-MTHFD1L與不良預(yù)后存在相關(guān)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步結(jié)果表明，敲低circ-MTHFD1L可以有效減少細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，當(dāng)circ-MTHFD1L表達(dá)低時(shí)，體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)率會(huì)受到抑制。最后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和蛋白質(zhì)印跡分析來探索circ-MTHFD1L、miR-217和E2F3之間的關(guān)系。以上結(jié)果證實(shí)了我們之前的假設(shè)，即circ-MTHFD1L可以通過抑制miR-217的表達(dá)來調(diào)節(jié)E2F3以控制PDAC的發(fā)展。

由于細(xì)胞類型特異性的特點(diǎn)，circRNA在包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管等疾病在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用[5]。然而目前關(guān)于circ-MTHFD1L的研究還很少，但以往關(guān)于其母基因MTHFD1L的許多研究結(jié)果都得出了與本研究相似的結(jié)論。在食管鱗狀細(xì)胞癌中，MTHFD1L在影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞進(jìn)展的葉酸循環(huán)中起關(guān)鍵作用[15]。另有研究顯示MTHFD1L在肝細(xì)胞癌中具有相同的機(jī)制，即MTHFD1L的敲低可以通過影響葉酸途徑阻礙肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖[16]。此外，circRNAs作為近年來的研究熱點(diǎn)。目前有研究揭示了在PDAC中表達(dá)不同的七種環(huán)狀RNA，這意味著各種環(huán)狀RNA與PDAC之間可能存在關(guān)系[17]。此外，hsa-circ-000977 經(jīng)證實(shí)可在circRNA沉默時(shí)顯著抑制PDAC進(jìn)展，與circ-MTHFD1L顯示出相同的功能[18]。

此外，之前的研究已經(jīng)研究了E2F3 和其他miRNA之間的聯(lián)系。有研究證實(shí)miR-152影響E2F3以調(diào)節(jié)C2C12成肌細(xì)胞的分化和增殖[18]。另有研究表明miR-203可以通過調(diào)節(jié)E2F3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲。在人肝細(xì)胞癌中，miR-214 可以通過靶向E2F3抑制肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖[19]。而miR-217是一種在各種細(xì)胞進(jìn)程中的關(guān)鍵基因，其功能已被研究miR-217具有激活Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)肝細(xì)胞癌干細(xì)胞特性的能力[20]。另有研究顯示miR-217 作為一種癌癥抑制劑，可以通過抑制AEG-1和PD-L1的表達(dá)來抑制喉癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[21]。然而，miR-217和E2F3在PDAC中的作用仍不清楚[20]。例如，E2F3 為什么會(huì)影響PDAC及其下游目標(biāo)是什么并未深入探討。這些問題都需要在以后的研究中進(jìn)一步探討。