雞球蟲疫苗和抗球蟲藥穿梭使用對雞球蟲耐藥性的影響

王 慶，曾憲軍，樊志紅，何佳楠，康樺華，何叔年，陳 杰，彭新宇

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站/廣東省中獸藥工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640；3.廣州市江豐實業(yè)股份有限公司，廣東 廣州 510510；4.廣州市江豐實業(yè)翁源有限公司，廣東 韶關(guān) 512600）

【研究意義】雞球蟲病是由一種或多種艾美爾球蟲（Eimeriaspp.）寄生于雞腸道引起的寄生蟲病，是集約化、規(guī)?；B(yǎng)雞場常見的疾病之一［1］。其致病機理主要是球蟲寄生在雞腸道粘膜內(nèi)，破壞雞腸道粘膜的完整性，引起腸道出血，造成腸道消化吸收機能障礙，而且腸道粘膜損傷致使其他條件性致病菌感染幾率提高，易繼發(fā)其他細菌感染［2-4］。該病一般暴發(fā)于3～6 周齡雛雞，死亡率可高達80%，幸存下來的雞只生產(chǎn)性能也會嚴重受損［1］。據(jù)估計，全世界養(yǎng)雞業(yè)每年因雞球蟲損失高達20 億美元［5］。我國是世界第二養(yǎng)雞大國，雞肉產(chǎn)量約占世界總量的12%。因此，有效防治雞球蟲病發(fā)展對雞養(yǎng)殖業(yè)具有重大意義。

【前人研究進展】目前控制雞球蟲病的主要手段，一是在飼料中添加抗球蟲藥，二是幼齡雞口服活卵囊疫苗［6-7］。常用球蟲藥大致包括兩類，一類為聚醚類離子載體抗生素，如莫能霉素、鹽霉素、那拉霉素、森杜拉霉素、馬杜拉霉素、拉沙洛霉素和海南霉素等；另一類為化學(xué)合成類抗球蟲藥，如克球粉、尼卡巴嗪、氨丙啉、地克珠利、球痢靈等。然而隨著抗球蟲藥的廣泛應(yīng)用，球蟲耐藥性也隨之出現(xiàn)［7-9］。為延緩耐藥性的產(chǎn)生，常采用在肉雞不同批次間或不同生長階段使用作用機制不同的藥物（即輪換用藥或穿梭用藥），但是球蟲耐藥性發(fā)展形勢仍未得到緩解［9-10］。雞球蟲活卵囊疫苗免疫原理是雞低水平多次感染球蟲產(chǎn)生免疫力，即口服疫苗球蟲在雞體內(nèi)繁殖產(chǎn)生蟲卵排出體外，之后雞再次從墊料中攝取孢子化蟲卵而再次感染，如此循環(huán)2～3 次，使雞對同類球蟲產(chǎn)生免疫力［7］。但由于球蟲免疫為帶蟲免疫，使用球蟲疫苗往往會降低雞群生產(chǎn)性能，造成飼料消耗增加，對經(jīng)濟效益造成消極影響［8］，而且目前仍不能準確控制球蟲疫苗接種后雞群從墊料攝入孢子化卵囊的數(shù)量，致使有部分雞攝入卵囊過多出現(xiàn)拉血等癥狀；此外，使用球蟲卵囊疫苗也會增加雞產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的幾率，促使壞死性腸炎的發(fā)生［11-12］。由于球蟲耐藥性普遍且球蟲疫苗免疫技術(shù)仍有待完善，因此目前防治雞球蟲病仍面臨巨大挑戰(zhàn)。為了在耐藥情況嚴峻的形勢下有效控制雞球蟲病，同時考慮到食品安全因素，人們不再只是依賴抗球蟲藥物，而是尋求更加安全有效的方法。目前已有很多養(yǎng)殖場采用抗球蟲藥和球蟲疫苗聯(lián)合應(yīng)用的方法以充分發(fā)揮球蟲疫苗的優(yōu)勢、延長抗球蟲藥的有效使用期。

【本研究切入點】目前球蟲疫苗和抗球蟲藥物的聯(lián)合使用方式有兩種，一種是穿梭使用方案（也稱生物穿梭方案），即同一批養(yǎng)殖雞群，在雛雞階段接種球蟲疫苗，之后使用抗球蟲藥；另一種為輪換使用方案，即一批或多批雞群養(yǎng)殖均采用球蟲疫苗控制球蟲病，之后一批雞再使用抗球蟲藥控制球蟲病。研究表明，采用輪換使用方案，對恢復(fù)球蟲藥物敏感性產(chǎn)生積極影響并取得良好經(jīng)濟效益［13-14］。而生物穿梭方案國內(nèi)外均有使用，但其對球蟲耐藥性的相關(guān)研究報道很少。為探討生物穿梭方案對養(yǎng)殖場中球蟲耐藥性的影響，本研究從前期使用球蟲疫苗、中后期使用預(yù)防抗球蟲藥（即采用生物穿梭方案）的肉雞養(yǎng)殖場采集糞便，分離球蟲蟲株，測試其耐藥性，同時在只使用抗球蟲藥物預(yù)防的雞場分離球蟲進行對比測試?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對比分析僅使用球蟲藥物雞場內(nèi)分離得到的球蟲和使用生物穿梭方案雞場分離得到的球蟲的耐藥性，以評價生物穿梭方案對球蟲的藥物敏感性恢復(fù)是否能夠產(chǎn)生積極作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲株 供試球蟲蟲株于2021 年4 月分離自廣州市花都區(qū)和清遠英德市。兩地所有采樣雞場各5 個，均使用廣州某飼料廠同種飼料，飼養(yǎng)同一品種麻黃肉雞?；ǘ疾蓸与u場均在4 日齡雛雞的飲水中添加1 頭份某品牌球蟲活疫苗，30日齡后飼料中添加抗球蟲藥，至采樣時為止，雞場均已連續(xù)采用上述生物穿梭方案12 個月。而英德采樣雞場長期在飼料中僅添加抗球蟲藥預(yù)防球蟲病，未曾使用過球蟲疫苗。

雛雞30 日齡時對每個雞場采集雞糞，用飽和鹽水漂浮法分離蟲卵，孢子化后用單卵囊法分離。每個雞場分別得到2 個柔嫩艾美爾球蟲蟲株，存于2.5%重鉻酸鉀溶液中，置于4 ℃保存。攻蟲前將同一來源地分離所得球蟲分別等比例混合，分別標記為花都蟲株和英德蟲株。

1.1.2 試驗動物 供試肉雞為1 日齡麻黃肉雞公雞苗，購自廣州市江豐實業(yè)股份有限公司，飼養(yǎng)在嚴格消毒無球蟲的動物房和金屬籠內(nèi)，自由飲水，自由采食。

1.1.3 供試藥物 供試藥物6 種：25%尼卡巴嗪預(yù)混劑（江西新鼎科技有限公司）、25%二硝托胺預(yù)混劑（浙江榮耀生物科技股份有限公司）、25%氯羥吡啶預(yù)混劑（廣東省前沿動物保健有限公司）、1%馬杜霉素預(yù)混劑（山東齊發(fā)藥業(yè)有限公司）、尼卡巴嗪馬杜霉素合劑（25%尼卡巴嗪預(yù)混劑和1%馬杜霉素預(yù)混劑1 ∶1 混合），拌料用量均為500 g/t；15%甲基鹽霉素預(yù)混劑〔禮藍（上海）動物保健有限公司〕，拌料用量為600 g/t。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗處理 雛雞18 日齡時，逐羽稱重，剔除體質(zhì)量過大、過小、體弱雛雞，隨機分組，各處理10 羽。試驗設(shè)空白對照、花都蟲株攻蟲對照、英德蟲株攻蟲對照、花都蟲株攻蟲用藥處理、英德蟲株攻蟲用藥處理，花都、英德蟲株攻蟲用藥處理各6 個，各處理飼料中分別添加上述6 種藥物。12 個攻蟲用藥處理分別從18 日齡開始給予相應(yīng)抗球蟲藥物8 d。除空白對照外，其余各處理肉雞于19 日齡口服接種5×104個球蟲孢子化卵囊。每天觀察并記錄各處理肉雞的飲水、采食、糞便以及死亡等情況，及時剖解死亡雞，分析死亡原因。攻蟲7 d 后，將雞只脫頸處死，稱重，剖檢，觀察并記錄盲腸病變，收集盲腸內(nèi)容物并刮取盲腸粘膜。

1.2.2 病理顯微觀察 盲腸樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 后，經(jīng)修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片等程序制作切片。采用顯微鏡觀察切片，在不同倍數(shù)下觀察組織病變情況。

1.2.3 球蟲耐藥性判定與評價［15］以抗球蟲指數(shù)（Anticoccidial Index,ACI）、最適抗球蟲活性百分比（Percent of Optimum Anticoccidial Activity，POAA）、病變記分減少率（Reduction of Lesion Scores，RLS）、相對卵囊產(chǎn)量（Relative Oocyst Productivity，ROP）4 項指標綜合判定球蟲耐藥性。

（1）ACI=（存活率+增重率）-（病變值+卵囊值）。ACI ≥180 判為優(yōu)秀，160 ＜ACI ＜179判為良好（記作-），120 ＜ACI ＜159 判為輕度或中度耐藥（記作±），ACI ＜120 判為無效、嚴重耐藥（記作+）。

病變值：兩側(cè)盲腸病變不一致時，以病變嚴重的一側(cè)記分。0 分：無明顯病變；1 分：盲腸壁有少量散在瘀點，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常；2 分：病變數(shù)量較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸腸壁稍增厚，內(nèi)容物正常；3 分：盲腸因充滿大量血液或腸芯而腫大，腸芯內(nèi)含有糞便；4 分：雞只死亡。

卵囊值：收集盲腸內(nèi)容物并刮取盲腸粘膜，加入1%胰蛋白酶，37 ℃消化2 h 后用血小板計數(shù)法計算每只雞盲腸勻漿內(nèi)的卵囊百萬數(shù)，計數(shù)結(jié)果＜0.1、0.1～1、2～5、6～10、＞11 對應(yīng)的卵囊值分別記作0、1、2、3、4。

（2）POAA=（攻蟲用藥處理GRS-攻蟲對照GRS）/（空白對照GRS-攻蟲對照GRS），GRS=籠末重/籠初重。POAA≤50%判為具有耐藥性（記作+），＞50%為敏感（記作-）。

（3）RLS（%）=（攻蟲對照的平均病變值-攻蟲用藥處理的平均病變值）/攻蟲對照的平均病變值×100。RLS ＜50%判為具有耐藥性（記作+），≥50%為完全敏感（記作-）。

（4）ROP（%）=攻蟲用藥處理排出的卵囊總數(shù)/攻蟲對照的卵囊總數(shù)×100。ROP ≥15%判定具有耐藥性（記作+），＜15%為敏感（記作-）。

（5）耐藥性綜合評價：通過ACI、POAA、RLS、ROP 指數(shù)對球蟲耐藥性進行綜合評價：++++/+++，判定球蟲嚴重耐藥；++，判定球蟲中度耐藥；+，判定球蟲輕度耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和剖檢病變

花都蟲株和英德蟲株的攻蟲對照肉雞均在感染4～5 d 后排稀便和血便，剖檢病死雞可見盲腸腫大、出血，盲腸內(nèi)血液與腸內(nèi)容物混合凝結(jié)，或呈粘稠狀，或呈干酪樣物質(zhì)凝塊（圖1）；其他各攻蟲用藥處理肉雞的盲腸呈現(xiàn)不同程度病變，粘膜出血，腸壁增厚，嚴重者盲腸明顯腫大、腸壁密布出血點，腸內(nèi)容物與血液混合凝結(jié)。

圖1 死亡肉雞的盲腸病征Fig.1 Cecum lesion characteristics of dead broilers

2.2 盲腸組織病變情況

與空白對照肉雞的正常盲腸組織切片（圖2A）對比可見，花都蟲株攻蟲對照（圖2B）和英德蟲株攻蟲對照（圖2C）肉雞的盲腸組織潰瘍，累及粘膜下層；盲腸粘膜層大量上皮及腸腺喪失，結(jié)締組織增生，伴有較多炎性細胞浸潤，包括淋巴細胞、粒細胞等。粘膜層可見較多卵囊，廣泛存在于腸腺上皮、腺腔以及結(jié)締組織內(nèi)，多處有蟲卵透過粘膜肌層浸潤至粘膜下層。粘膜下層有較多淋巴組織和結(jié)締組織增生，局部水腫，致使粘膜下層增寬。

圖2 空白對照（A）、花都蟲株攻蟲對照（B）、英德蟲株攻蟲對照（C）肉雞的盲腸組織切片F(xiàn)ig.2 Caecum tissue sections of broilers in blank control (A),Huadu isolates challenge control(B)and Yingde isolates challenge control(C)

2.3 6 種藥物對不同來源蟲株的ACI 比較

試驗各處理的存活率、增重率、病變值、卵囊值以及ACI 指數(shù)值結(jié)果見表1。對花都蟲株，尼卡巴嗪、氯羥吡啶、馬杜霉素3 種藥物均表現(xiàn)為ACI＜120，其他藥物為120＜ACI＜159，據(jù)此判斷花都蟲株對尼卡巴嗪、氯羥吡啶、馬杜霉素嚴重耐藥，對其他3 種藥物中度耐藥。而英德蟲株對6 種藥物均表現(xiàn)為120＜ACI＜159，判斷英德蟲株對供試所有藥物均中度耐藥。

表1 6 種藥物對花都、英德蟲株的ACI 比較Table 1 Comparison of ACI of six drugs to Huadu and Yingde isolates

2.4 6 種藥物對不同來源蟲株的POAA 比較

試驗各處理的體重變化以及POAA 結(jié)果見表2。對花都蟲株，僅尼卡巴嗪馬杜霉素合劑的POAA＞50%、為65.95%，其他藥物的POAA＜50%，判斷花都蟲株僅對尼卡巴嗪馬杜霉素合劑表現(xiàn)敏感，對其他5 種藥物表現(xiàn)耐藥。英德蟲株對6 種藥物均表現(xiàn)為POAA＞50%，據(jù)此判斷對供試所有藥物均表現(xiàn)敏感，其中對二硝托胺、甲基鹽霉素的POAA＞75%。

表2 6 種藥物對花都、英德蟲株的POAA 比較Table 2 Comparison of POAA of six drugs to Huadu and Yingde isolates

2.5 6 種藥物對不同來源蟲株的RLS 和ROP 比較

試驗各處理的RLS 值和ROP 值結(jié)果見表3。花都、英德蟲株對6 種藥物均表現(xiàn)出RLS＜50%、ROP＞15%，據(jù)此判斷花都蟲株和英德蟲株對供試所有藥物均表現(xiàn)耐藥，且花都蟲株球蟲卵囊產(chǎn)量基本不受抗球蟲藥物影響。

表3 6 種藥物對花都、英德蟲株的RLS 和ROP 比較Table 3 Comparison of RLS and ROP of six drugs to Huadu and Yingde isolates

2.6 不同來源蟲株對6 種藥物的耐藥性綜合評價

從ACI、POAA、RLS、ROP 4 個耐藥性指標（表4）綜合判斷，花都蟲株對尼卡巴嗪馬杜霉素合劑中度耐藥，對其余5 種藥物嚴重耐藥；英德蟲株對供試的6 種藥物均表現(xiàn)中度耐藥；兩個來源蟲株均表現(xiàn)出多重耐藥。

表4 花都、英德蟲株對6 種藥物的耐藥性綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of resistances of Huadu and Yingde isolates to six drugs

3 討論

評價雞球蟲耐藥性常用的指標有抗球蟲指數(shù)（ACI）、最適抗球蟲活性百分比（POAA）、病變計分減少率（RLS）和相對卵囊產(chǎn)量（ROP）等，這4 個指標從不同側(cè)面反映球蟲耐藥性。其中ACI 較為均衡地從存活率、增重、卵囊產(chǎn)量、病變等4 個方面反映抗球蟲藥的效果，而POAA、RLS 和ROP 則分別從增重、病變和卵囊產(chǎn)量反映球蟲耐藥性。試驗綜合4 個指標對2 個來源的柔嫩艾美爾球蟲蟲株的耐藥性進行判斷，可見花都、英德蟲株對常用6 種藥物均表現(xiàn)出明顯的耐藥性且表現(xiàn)為多重耐藥，這與國內(nèi)外關(guān)于雞球蟲耐藥性形勢報道一致［16-23］。試驗結(jié)果反映了雞球蟲耐藥性的嚴重性，抗球蟲藥在控制球蟲病發(fā)展的應(yīng)用中處于嚴峻困境。

本研究球蟲蟲株樣本來源的兩地雞場所用的肉雞品種、飼料均相同。其中花都5 個雞場采用了球蟲活卵囊疫苗和抗球蟲藥物穿梭方案控制球蟲病已有1 年，而英德5 個雞場長期只使用抗球蟲藥預(yù)防球蟲病，從未使用過球蟲疫苗。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花都蟲株和英德蟲株均表現(xiàn)為多重耐藥性，這提示生物穿梭方案并不能明顯改善雞場球蟲的耐藥性。究其原因，在于球蟲活卵囊疫苗和抗球蟲藥物穿梭使用過程中，雞群對球蟲產(chǎn)生抗體從而控制球蟲病的發(fā)展，但野生蟲株仍在環(huán)境中存活，生長后期抗球蟲藥物的配合使用在消除疫苗對雞體造成的亞感染狀態(tài)方面起到一定作用，但促進生長的同時也使得環(huán)境中的球蟲蟲株再次處于抗球蟲藥物的篩選壓力下，不利于雞場內(nèi)球蟲蟲株藥物敏感性的恢復(fù)。

而有關(guān)球蟲活卵囊疫苗和抗球蟲藥物輪換使用方案的效果研究表明，輪換使用方案可以改善球蟲耐藥性［14,24］。Vereecken 等［24］對某雞場接種雞球蟲疫苗前后分離得到的球蟲蟲株進行藥物敏感性檢測，發(fā)現(xiàn)接種疫苗后分離所得球蟲蟲株對藥物敏感性有所恢復(fù)。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，輪換方案中使用球蟲疫苗的時間比穿梭方案更長，可更有效地將野生耐藥蟲株占比降到更低。此外，有研究表明采用輪換方案時，在一批或幾批雞使用疫苗后，出欄時需要保留一部分墊料，從而使疫苗蟲株在環(huán)境中延續(xù)到下一批雞養(yǎng)殖周期，保持敏感蟲株在環(huán)境中的種群數(shù)量優(yōu)勢。Chapman等［13］提出利用球蟲活疫苗與藥物輪換使用，有可能恢復(fù)場地球蟲的敏感性，并提出每年三輪換的控制計劃，即4 個月采用藥物控制球蟲方法養(yǎng)2 批雞，徹底消毒清場；接著4 個月采用球蟲疫苗養(yǎng)2 批雞；再接著4 個月采用藥物養(yǎng)2 批雞；再4 個月采用藥物養(yǎng)二批雞，徹底消毒清場……如此循環(huán)，其中，藥物轉(zhuǎn)疫苗前要徹底清欄，而疫苗轉(zhuǎn)藥物前不要徹底清欄。Snyder 等［18］也發(fā)現(xiàn)每批雞出欄后清除墊料會限制疫苗蟲株在場地中形成優(yōu)勢，也縮短了藥物敏感性提高的持續(xù)時間。

4 結(jié)論

本研究分離得到的不同來源雞柔嫩艾美爾球蟲蟲株，均對尼卡巴嗪、二硝托胺、氯羥吡啶、馬杜霉素、甲基鹽霉素、尼卡巴嗪馬杜霉素合劑6 種藥物表現(xiàn)出中度到嚴重耐藥，可見目前雞場的球蟲耐藥性仍然很嚴重，且呈現(xiàn)多重耐藥性。與僅使用抗球蟲藥物防制方案的雞場相比，采用球蟲疫苗和抗球蟲藥穿梭方案雞場分離得到的柔嫩艾美爾球蟲對常見的6 種抗球蟲藥仍然表現(xiàn)中度耐藥，蟲株對藥物敏感性未見明顯恢復(fù)，提示疫苗與藥物穿梭使用對恢復(fù)抗球蟲藥物敏感性作用不明顯。