利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定雞蛋中6種喹諾酮藥物的殘留

張麗靜 郭曉冬 韓江升

摘 要：目的：利用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)快速準(zhǔn)確地測(cè)定雞蛋中6種喹諾酮類藥物（恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星）的殘留。方法：樣品用酸化乙腈溶液提取，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮定容后經(jīng)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量分析。結(jié)果：在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，6種喹諾酮類藥物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，檢出限為1～4 ?g·L-1，回收率在70.4%～117.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%。結(jié)論：該方法可以滿足雞蛋中上述6種喹諾酮類藥物的測(cè)定需求。

關(guān)鍵詞：固相萃取；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；喹諾酮；雞蛋

Simultaneously Detection of Six Fluoroquinolones Residue in Eggs Using High-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Lijing1， GUO Xiaodong1， HAN Jiangsheng2*

（1.Wendeng District Inspection and Testing Center， Weihai 264400， China;

2.Shandong Wego Pharmaceutical Co.， Ltd.， Weihai 264200， China）

Abstract： Objective： To use high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry to simultaneously rapidly and accurately determine six quinolones （enrofloxacin， ciprofloxacin， ofloxacin， norfloxacin， pefloxacin and lomefloxacin） in eggs. Method： The samples were extracted with acidified acetonitrile solution， dried with anhydrous sodium sulfate， concentrated to constant volume， purified by Oasis PRiME HLB solid phase extraction column， determined by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer， and quantitatively analyzed by internal standard method. Result： Within the corresponding concentration range， the six quinolones had a good linear relationship， the correlation coefficient R2 was greater than 0.99， the detection limit was 1～4 ?g·L-1， the recovery rate was 70.4%～117.8%， and the relative standard deviation was less than 15%. Conclusion： This method can meet the determination requirements of the above six quinolones in eggs.

Keywords： solid phase extraction; high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; fluoroquinolones; egg

蛋白質(zhì)的攝入為人的生命活動(dòng)提供了豐富的氨基酸。其中，雞蛋的食用是居民日常蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一[1-2]。為提高蛋雞的生存率及產(chǎn)蛋率，在蛋雞養(yǎng)殖過(guò)程中不合規(guī)使用或者濫用藥物已經(jīng)成為養(yǎng)殖戶的常規(guī)手段，也是近幾年在檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的常見性問(wèn)題[3-7]。在這些藥物中，喹諾酮類獸藥是近年來(lái)人工合成的一系列新型殺菌性抗菌藥物，因其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物的多種感染性疾病的防治[8]。長(zhǎng)期食用含較低濃度喹諾酮類藥物的動(dòng)物源性食品，容易誘導(dǎo)人類產(chǎn)生致病菌耐藥性，具有潛在致畸致癌的威脅[9]。中國(guó)和歐盟都規(guī)定了在動(dòng)物組織中喹諾酮類獸藥的最高殘留量。通過(guò)儀器快速準(zhǔn)確地測(cè)定雞蛋中喹諾酮類獸藥的殘留具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前我國(guó)已經(jīng)制定了相關(guān)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同種類的食品中的喹諾酮類藥物進(jìn)行檢測(cè)。

本研究參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法，選取雞蛋的日常監(jiān)管過(guò)程中檢測(cè)頻率較高的6種喹諾酮類藥物，整合優(yōu)化檢測(cè)方法，建立了一種簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的基于固相萃取和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中6種喹諾酮類藥物殘留量的檢測(cè)方法，該方法具有良好的回收率、穩(wěn)定性和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 材料

雞蛋，購(gòu)于文登大潤(rùn)發(fā)商業(yè)有限公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA）；甲酸（色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；乙酸銨（分析純，天津市永達(dá)化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水硫酸鈉（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（購(gòu)于北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5，質(zhì)量濃度均為100 ?g·mL-1。

1.3 儀器設(shè)備

TSQ Quantum Ultra EMR System三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Short（335 mg，Waters公司）；PL2002，0.01 g電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；3-18KS高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司）；N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；N-EVAPTM 112氮吹儀（美國(guó)organomation公司）；AH-30全自動(dòng)均質(zhì)儀（?？萍瘓F(tuán)股份有限公司）；C18色譜柱：Hypersil gold（C18），100 mm×2.1 mm，3.0 ?m（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5混合內(nèi)標(biāo)溶液的配制。分別準(zhǔn)確吸取1 mL 100 ?g·mL-1的恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙腈稀釋配成10 ?g·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（2）恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星6種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制。準(zhǔn)確吸取1 mL 100 ?g·mL-1的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈稀釋成濃度為10 ?g·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（3）6種喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制（內(nèi)標(biāo)法）。分別取適量的6種喹諾酮藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和3種氘代混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，用乙腈稀釋成6種喹諾酮藥物濃度為10 ?g·L-1、20 ?g·L-1、50 ?g·L-1、80 ?g·L-1、100 ?g·L-1和200 ?g·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.2 供試樣品前處理

準(zhǔn)確稱取勻漿后的蛋液5 g（精確到0.01 g），置于50 mL聚乙烯離心管中，依次加入3種氘代內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液50 ?L，25 mL含1%甲酸的乙腈溶液，均質(zhì)2 min（轉(zhuǎn)速12 000 r·min-1），加入5 g無(wú)水硫酸鈉，蓋緊旋塞劇烈振搖2 min，離心5 min（4 000 r·min-1），使有機(jī)相和水相分層。取出上層有機(jī)相于100 mL雞心瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，放冷，用乙腈稀釋至5.0 mL，搖勻。

取上述制備的提取液5 mL，通過(guò)Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Short（335 mg）凈化，收集全部?jī)艋?，混勻，? mL凈化液在40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL乙腈-水（1∶9，v∶v）定容，混勻，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L；流速：0.2 mL·min-1；流動(dòng)相：溶劑A（含5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液），溶劑B為甲醇；梯度洗脫條件：0～1 min，10%B；1～7 min，10%B→35%B；7～9 min，35%B→70%B；9～12 min，70%B；12.1～15.0 min，10%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源（HESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）；氬氣為碰撞氣；碰撞氣壓力為0.2 Pa；樣品傳輸管溫度為350 ℃；蒸發(fā)器溫度為300 ℃；鞘氣流速為35 Arb；輔助氣流速為10 Arb；噴霧電壓為3 500 V；離子掃描模式為正離子掃描模式。

（3）離子參數(shù)的優(yōu)化。分別取濃度為1 ?g·mL-1的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星各藥物單標(biāo)溶液，采用流動(dòng)注射分析法進(jìn)樣，用軟件自帶的優(yōu)化功能分別對(duì)各個(gè)化合物進(jìn)行優(yōu)化，選擇信號(hào)強(qiáng)度較高的兩組離子對(duì)作為定性和定量離子。優(yōu)化后的離子參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍的測(cè)定

將1.4.1（3）配制的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測(cè)定，以待測(cè)化合物與內(nèi)標(biāo)化合物峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以S/N=3確定儀器檢出限。由表2可知，在10～200 ?g·L-1，各種藥物呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。以信噪比（S/N）為3計(jì)算方法的檢出限（LOD），得6種喹諾酮類藥物的LOD在1～4 ?g·L-1，完全滿足檢測(cè)需求。

2.2 方法的回收率和精密度

以雞蛋陰性樣品為基質(zhì)，分別添加10 ?g·kg-1、80 ?g·kg-1、200 ?g·kg-1這3個(gè)濃度的喹諾酮類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度做6個(gè)平行樣品，采用內(nèi)標(biāo)法定量。由表3可知，在3個(gè)加標(biāo)水平下，6種喹諾酮類藥物的回收率為70.4%～117.8%，RSD均在15% 以內(nèi)。表明本方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可以滿足雞蛋中6種喹諾酮類藥物的檢測(cè)需求。

2.3 檢測(cè)方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中用到的提取溶劑主要包括兩種，即酸化乙腈和磷酸鹽緩沖液。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用磷酸鹽緩沖液作為提取溶劑時(shí)，即使用高速離心機(jī)離心后，提取液仍不易澄清，在后續(xù)過(guò)柱凈化的過(guò)程中過(guò)柱非常緩慢。而用酸化乙腈提取時(shí)，后續(xù)過(guò)固相萃取柱凈化就比較容易，所以本文選用酸化乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 凈化材料的選擇

雞蛋是卵磷脂含量最高的食物之一，此外還含有大量的脂肪；在樣品處理過(guò)程中，簡(jiǎn)單有效的凈化手段對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)在樣品前處理過(guò)程中采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化，可以有效去除干擾物質(zhì)，并且使待測(cè)物保持了較高的回收率。

2.3.3 定量方法的選擇

為消除樣品處理過(guò)程中目標(biāo)物的損失和基質(zhì)效應(yīng)等因素的影響，本實(shí)驗(yàn)選用同位素內(nèi)標(biāo)法來(lái)進(jìn)行定量，同位素內(nèi)標(biāo)法以待測(cè)組分和同位素內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)信號(hào)比來(lái)定量，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。

3 結(jié)論

本文以酸化乙腈作為提取溶劑，以O(shè)asis PRiME HLB Cartridge Plus Short凈化柱作為凈化材料用于雞蛋的前處理，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜法分析檢測(cè)了6種喹諾酮類藥物殘留，建立了同位素質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定雞蛋中6種喹諾酮類藥物的方法，并對(duì)方法進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，本文所建立的檢測(cè)方法的線性方程、準(zhǔn)確度、精密度和檢出限等指標(biāo)都滿足檢測(cè)需求，表明該檢測(cè)方法是準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便的，可用于日常對(duì)雞蛋中喹諾酮類藥物殘留的監(jiān)測(cè)分析。

參考文獻(xiàn)

[1]王延云，龔衛(wèi)華，王燕，等.峨邊山地散養(yǎng)青腳麻雞雞蛋品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].樂(lè)山師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2022（4）：23-27.

[2]PARA I.Protein and energy requirements： a joint FAO/WHO memorandum[J].Bulletin of the World Health Organization，1979，57（1）：65-79.

[3]吳亞軍.蛋雞濫用獸藥的危害[J].吉林畜牧獸醫(yī)，2021（43）：51-53.

[4]李有志，魏茂蓮，楊修鎮(zhèn)，等.山東省蛋雞產(chǎn)蛋期安全用藥情況的調(diào)研分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2021（55）：73-78.

[5]龐久龍.蛋雞的無(wú)抗養(yǎng)殖[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2021（4）：182.

[6]李建福，王介剛.蛋雞疾病防治安全用藥探析[J].家禽科學(xué)，2018（2）：35-37.

[7]李建福，王介剛.蛋雞疾病防治的安全用藥[J].中國(guó)畜牧業(yè)，2017（24）：79-80.

[8]魏東.喹諾酮類藥物特性及其常用藥[J].中國(guó)獸藥雜志，2007（4）：37-40.

[9]余澄清.喹諾酮類藥物不良反應(yīng)與用藥注意事項(xiàng)[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2005，11（8）：73-75.