哈爾濱市道里區(qū)蔬菜基地生菜和水土環(huán)境中常見細菌污染調(diào)查分析

黃翠 單宏 李莉莉 梁溪桐 蘭靜 張瑞英

摘 要：目的：了解哈爾濱市生菜和生菜生長水土環(huán)境中常見細菌的污染情況，為調(diào)查和預防生菜中潛在的風險因子提供參考。方法：采集2019—2021年哈爾濱市周邊3個生菜種植基地生菜樣品200份，水土環(huán)境樣品70份，參照相關國家標準，對大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌進行檢測。用SPSS軟件進行相關統(tǒng)計分析。結(jié)果：生菜及環(huán)境樣品中，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出，土壤中大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率均高于生菜（p<0.05），紫葉生菜中蠟樣芽孢桿菌檢出率高于綠葉生菜（p<0.05）；綠葉生菜中大腸菌群檢出率2020年高于2019年和2021年（p<0.05），蠟樣芽孢桿菌檢出率2020年高于2021年（p<0.05）和2019年（p<0.05）。結(jié)論：生菜和水土環(huán)境中分別檢出了大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌，生食生菜具有一定的安全隱患，相應的細菌污染來源值得關注，建議從生菜生產(chǎn)源頭加強產(chǎn)地安全監(jiān)管，保障生菜質(zhì)量安全。

關鍵詞：生菜；大腸菌群；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；蠟樣芽孢桿菌

Analysis on the Contamination of Four Common Bacteria in the Lettuce and Environmental Water and Soil in Daoli District in Harbin City

HUANG Cui1，2，3， SHAN Hong1，2，3*， LI Lili1，2，3， LIANG Xitong1，2，3， LAN Jing1，2，3， ZHANG Ruiying1，2，3

（1.Institute of Quality and Safety of Agricultural Products， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China; 2.Inspection and Testing Center for Quality of Cereals and Their Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China; 3.Agricultural Products Quality and Safety Risk Assessment Laboratory， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China）

Abstract： Objective： To understand the common bacterial contamination in lettuce and enviromental water and soil samples in Harbin， and to provide reference for the investigation and prevention of potential risk factors in lettuce. Method： 200 lettuce and 70 environmental soil and water samples were collected from three lettuce planting bases in Harbin from 2019 to 2021. Coliform， Salmonella， Staphylococcus aureus and Bacillus cereus were tested with reference to relevant national standards. SPSS 16.0 software was used to make statistical analysis of the detection rate. Result： Salmonella and Staphylococcus aureus were not detected in lettuce and environmental samples. The positive rate of coliform and Bacillus cereus in soil samples was higher than that in lettuce （p<0.05）， and that in purple leaf lettuce was higher than that in green leaf lettuce （p<0.05）. The detection rate of coliform in green lettuce in 2020 was higher than that in 2019 and 2021 （p<0.05）; the detection rate of Bacillus cereus in 2020 was higher than that in 2021 （p<0.05） and 2019 （p<0.05）. Conclusion： Raw lettuce has a certain potential safety hazard， it is suggested to strengthen the safety supervision from the source of lettuce production to ensure the quality and safety of lettuce.

Keywords： Lettuce; coliform; Salmonella; Staphylococcus aureus; Bacillus cereus

隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的提高，人們對健康愈發(fā)重視，開始注重葷素搭配、營養(yǎng)均衡，喜食時令蔬菜。生菜作為即食蔬菜的一種，深受北方人們的喜愛，食用量很大[1]。但因其簡單清洗即可入口，本身可能存在食源性致病菌也引起了人們的擔憂[2]。受近年來食源性致病菌食品安全問題的影響[3]，為保障人們的身體健康，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指導多地開展了即食果蔬中致病菌風險因子調(diào)查評估[4-5]。本文對2019—2021年哈爾濱市3個蔬菜種植基地種植的生菜及生長水土環(huán)境中常見細菌進行了調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2019—2021年，分別采集哈爾濱市3個蔬菜基地7—8月份的大棚栽培綠葉生菜、紫葉生菜及水土環(huán)境樣品，采樣過程中佩戴無菌手套并將樣本置于無菌袋內(nèi)，立即送往實驗室，當日進行檢測，3年樣本采集情況如表1所示。

1.1.2 儀器與試劑

（1）儀器。ABI 7500實時熒光定量PCR儀、拍擊式均質(zhì)器等。

（2）試劑。北京聚和美M5 GoldStar TaqMan Mixture聚合酶；北京陸橋生理鹽水、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）、50%卵黃液、P-36E多黏菌素B、營養(yǎng)瓊脂、0.1%Chelex；所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.1.3 標準菌株

大腸埃希氏菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC14028、金黃色葡萄球菌ATCC6538、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778，均購自北京中原公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

（1）細菌的檢測。生菜及環(huán)境樣品中大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌檢驗依次參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）、《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）、《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）和《蠟樣芽胞桿菌檢驗》（GB 4789.14—2014）進行測定。澳大利亞等國對即食食品中微生物限量要求是大腸菌群數(shù)量小于104 CFU·g-1，為可接受水平[6]；我國衛(wèi)生行業(yè)標準《蠟樣芽胞桿菌食物中毒診斷標準及處理原則》（WS/T 82—1996）對蠟樣芽孢桿菌數(shù)量的要求為大于105 CFU·g-1的食品會引起食物中毒[7]。

（2）DNA提取及PCR反應。挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落，加20 μL 0.1% Chelex，沸水浴5 min后，12 000 r·min-1離心5 min，取上清以備PCR反應。參照《出口食品中食源性致病菌檢測方法 實時熒光PCR法》（SN/T 1870—2016）和《出口食品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法-實時熒光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中引物序列，反應體系及反應程序。

1.2.2 統(tǒng)計方法

用SPSS 16.0軟件對兩個檢出率差異性做χ2檢驗統(tǒng)計分析，檢驗水準為0.05。對于樣本量小于40的樣本做Fisher精確檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和水土環(huán)境中細菌檢出情況

如表2、表3所示，2019—2021年共采集哈爾濱市3個蔬菜生產(chǎn)基地生菜和環(huán)境樣品270份。其中，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出。生菜中大腸菌群檢出率為60.00%（120/200），蠟樣芽孢桿菌檢出率為59.00%（118/200），紫葉生菜蠟樣芽孢桿菌檢出率高于綠葉生菜（90.24%＞50.94%，χ2=20.812，p<0.05）。土壤中的大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率高于生菜中（大腸菌群：94.29%＞60.00%，χ2=15.413，p<0.05；蠟樣芽胞桿菌為100.00%＞59.00%，χ2=22.041，p<0.05）。

不同年份綠葉生菜中大腸菌群檢出率為2020年高于2019年（χ2=28.719，p<0.05）、2021年（χ2=14.783，p<0.05），2020年蠟樣芽孢桿菌檢出率高于2021年（χ2=9.752，p<0.05）和2019年（χ2=25.297，p<0.05），差異均為顯著。紫葉生菜中大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌檢出率隨年份不同沒有顯著差異。

2.2 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和水土環(huán)境中大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌污染濃度情況生菜及環(huán)境樣品中大腸菌群檢出濃度如表4所示。生菜中大腸菌群檢出濃度多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，環(huán)境水中多集中在10～99 CFU·g-1，土中多集中在100～999 CFU·g-1，均未超過104 CFU·g-1。

生菜及環(huán)境樣品中蠟樣芽孢桿菌檢出濃度如表5所示。綠葉生菜蠟樣芽孢桿菌檢出范圍多在100～999 CFU·g-1，紫葉生菜多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，環(huán)境水中多集中在10～99 CFU·g-1，土中則集中在10 000～99 999 CFU·g-1，均未超過105 CFU·g-1。

3 討論

本文對2019—2021年哈爾濱市蔬菜生產(chǎn)基地中生菜及水土環(huán)境樣品中大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌污染情況進行了調(diào)查，大腸菌群作為糞便污染的衛(wèi)生指標菌，反映了生菜樣品的衛(wèi)生情況。參照澳大利亞等國對即食食品中微生物限量要求，大腸菌群數(shù)量小于104 CFU·g-1，為可接受范圍，當大腸菌群數(shù)量大于104 CFU·g-1時，為不合格產(chǎn)品[6]。本次對哈爾濱市基地生菜的調(diào)查，大腸菌群的檢出率為60.00%，檢出濃度均未超過不合格濃度。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是兩種常見的致病菌，本次調(diào)查中均未檢出。在以往的研究中鮮有沙門氏菌在生菜中檢出的報道，而金黃色葡萄球菌在河南省[4]、浙江省[8]的生菜樣品中均有檢出的報道。本次金黃色葡萄球菌在生菜和種植環(huán)境樣本的調(diào)查中均未檢出，這可能與地域、氣候、環(huán)境或種植方式不同有關[9]。蠟樣芽孢桿菌為條件致病菌，當蠟樣芽孢桿菌濃度到達105 CFU·g-1時，可能引起食物中毒[7]，此次對哈爾濱市基地生菜的調(diào)查，蠟樣芽孢桿菌檢出率為59.00%，但檢出濃度均未超過105 CFU·g-1?？傮w而言，雖然本次調(diào)查大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌檢出比率較高，但檢出濃度并未超過風險濃度，但考慮到微生物隨溫度有一定的消長，紫葉生菜蠟樣菌定量分析，考慮其即食性，仍存在一定的食品安全隱患。

就不同年份來說，哈爾濱市基地綠葉生菜中大腸菌群檢出率2020年高于2019年和2021年，蠟樣芽孢桿菌檢出率2020年高于2021年和2019年，這可能與不同年份氣候條件變化有關[10]。就不同生菜類型講，紫葉生菜中蠟樣芽孢桿菌污染風險較綠葉生菜高，這可能與葉片中色素種類及含量不同或葉片的表面質(zhì)地不同對致病菌吸附能力不同有關[11]。對于種植環(huán)境水的調(diào)查，本文采集了剛抽取上來的地下水（哈爾濱蔬菜基地多以抽取地下水灌溉為主）、地表的殘水和水缸中殘留的雨水，發(fā)現(xiàn)大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出的樣品多為地表的殘水和水缸中殘留的雨水，而地下水基本未檢出，說明剛抽取上來的地下水相對較好。對于土壤的調(diào)查，本文采集了種植土，其大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率與檢出濃度均較高，土壤中大腸菌群可能與農(nóng)家肥的施用有關，而土壤中含有較多的蠟樣芽孢桿菌芽孢[12]，并且土壤中蠟樣芽孢桿菌檢出率高于生菜，推測生菜中蠟樣芽孢桿菌污染可能來自土壤，這一觀點與劉一倩等[13]的研究相同。

目前，國內(nèi)外尚未有初級農(nóng)產(chǎn)品中衛(wèi)生指標菌與致病菌限量標準。已經(jīng)實施的《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[14]中僅規(guī)定了即食果蔬制品中致病菌限量，即將實施的《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[15]中有蠟樣菌限量規(guī)定，雖僅限米制品，也可借鑒參考。廣東省2016年頒布了食品安全地方標準《非預包裝即食食品微生物限量》（DBS 44/006—2016），標準規(guī)定去皮或預切的果蔬或果蔬食品中，沙門氏菌不得檢出，大腸埃希氏菌超過102 CFU·g-1，金黃色葡萄球菌超過104 CFU·g-1，蠟樣芽孢桿菌超過105 CFU·g-1，為不合格樣品[16]。我國農(nóng)產(chǎn)品中食源性致病菌風險評估工作起步較晚，基礎數(shù)據(jù)不充分，農(nóng)產(chǎn)品中風險因子不清，來源不明，鑒于近年來國際上由致病菌引發(fā)的食品安全事件時有發(fā)生[17-18]，而國際間往來頻繁，國際貿(mào)易持續(xù)增長，存在食源性致病菌傳入我國的風險，因此建議加大對我國農(nóng)產(chǎn)品，尤其是即食果蔬中致病菌風險評估的力度，充實數(shù)據(jù)，保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，確保我國出口果蔬的產(chǎn)品質(zhì)量，提升我國農(nóng)產(chǎn)品在國際市場上的地位[19]。同時，加快推進實施良好農(nóng)業(yè)操作規(guī)范、良好生產(chǎn)規(guī)范和良好衛(wèi)生規(guī)范在內(nèi)的管理體系，完善生產(chǎn)、運輸和銷售產(chǎn)業(yè)鏈管理體系也能有效減少病原微生物的污染和傳播[20-21]。

參考文獻

[1]楊攀，楊詩雯，李磊，等.生菜研究進展綜述[J].現(xiàn)代園藝，2020，43（15）：34-36.

[2]錢程，馬晨，湯永嬌，等.果蔬中食源性致病微生物的研究進展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2014，34（12）：85-93.

[3]ROBERTO B，SARA A，ELENA D，et al.Foodborne botulism survey in Northern Italy from 2013 to 2020： Emerging risk or stable situation？[J].Food Control，2021，132（1）：108520.

[4]張可可，趙光華，郝學飛，等.2015年鄭州市即食生鮮果蔬病原微生物調(diào)查與風險分析[J].河南預防醫(yī)學雜志，2017，28（5）：325-328.

[5]肖興寧，王珍，蔡錚，等.浙江省即食生鮮果蔬病原微生物污染調(diào)查分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2020，61（3）：528-530.

[6]劉芳，蘭全學，李碧芳，等.國內(nèi)外即食食品微生物限量標準解析[J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（2）：215-223.

[7]中華人民共和國衛(wèi)生部.蠟樣芽胞桿菌食物中毒診斷標準及處理原則：WS/T 82—1996[S].北京：中國標準出版社，1996.

[8]肖興寧，王珍，何天，等.浙江省生菜致病微生物污染現(xiàn)狀與分析[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2020，61（11）：2333-2335.

[9]關文強，井澤良，張娜，等.新鮮果蔬流通過程中致病微生物種類及其控制[J].保鮮與加工，2008，8（1）：1-4.

[10]LIU C，HOFSTRA N，F(xiàn)RANZ E.Impacts of climate change on the microbial safety of pre-harvest leafy green vegetables as indicated by Escherichia coli O157 and Salmonella spp[J].International Journal of Food Microbiology，

2013，163（2/3）：119-128.

[11]PATEL J，SHARMA M.Differences in attachment of Salmonella enterica serovars to cabbage and lettuce leaves [J].International Journal of Food Microbiology，2010，139（1/2）：41-47.

[12]李鵬飛.中國區(qū)域芽胞桿菌分布特征[D].福州：福建農(nóng)林大學，2020.

[13]劉一倩，易欣欣.新鮮蔬果中食源性致病細菌研究進展[J].生物技術(shù)通報，2014（4）：19-24.

[14]中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量：GB 29921—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

[15]中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量：GB 31607—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

[16]廣東省衛(wèi)生和計劃生育委員會.非預包裝即食食品微生物限量：DBS 44/006—2016[EB/OL].（2016-07-27）[2022-07-11].http：//down.foodmate.net/standard/sort/15/49104.html.

[17]IMRE K?LM?N，HERMAN VIOREL，MORAR ADRIANA.Scientific achievements in the study of the occurrence and antimicrobial susceptibility profile of major foodborne pathogenic bacteria in foods and food processing environments in Romania： review of the last decade[J].Biomed Research International，2020，2020： 5134764.

[18]HARADA T，TAGUCHI M，KAWAHARA R，et al.

Prevalence and antimicrobial susceptibility of bacterial pathogens in ready-to-eat foods retailed in Osaka Prefecture， Japan[J].Journal of food protection，2018，81（9）：1450-1458.

[19]白莉，王曄茹，王彝白納，等.我國食品微生物風險評估的進展和挑戰(zhàn)[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2020，32（6）：

598-603.

[20]孔巍，李春天，黃魁建，等.全面推行良好農(nóng)業(yè)規(guī)范（GAP）的有效路徑探索[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2020（6）：41-44.

[21]周向陽，夏英，薛桂霞，等.基于良好農(nóng)業(yè)規(guī)范的日本農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全管理經(jīng)驗及啟示[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全，2020（2）：90-94.