基于ITS2 序列及二級結(jié)構(gòu)對紫蘇與其變種、紫蘇子與其混偽品的鑒別

鄭夢迪， 賀紫涵， 張 春， 汪興軍

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021）

紫蘇Perilla frutescens（L.） Britt.為唇形科紫蘇屬植物，是一種常見的藥食兩用植物資源[1]，據(jù)2015版《中國藥典》記載，紫蘇干燥成熟的果實(shí)入藥稱為紫蘇子，具有降氣化痰、止咳平喘、潤腸通便的作用；其干燥葉（或帶嫩枝）為紫蘇葉入藥，具有解表散寒、行氣和胃的功效[2]。 由于紫蘇屬下變種較多，歷代本草文獻(xiàn)中對于紫蘇及其變種用途及分類的記載混亂，其植物命名和分類爭議存在已久[3-4]。 魏晉時期《名醫(yī)別錄》最早記載紫蘇入藥，分為“蘇”和“荏”，“蘇”即現(xiàn)代所使用的紫蘇，“荏”即指白蘇[3]。南宋王介編繪的《履巉巖本草》中記載了野蘇，經(jīng)考證為紫蘇的近似種。 《本草綱目》中除對紫蘇和白蘇的記載， 另外還收錄了一種花紫蘇，“其葉細(xì)齒，紐如剪成之狀， 色香莖子并無異者， 人稱回回蘇”[3]?！吨袊参镏尽穼ψ咸K屬劃分為紫蘇P. frutescens（原變種）、白蘇P. frutescens var. frutescens、回回蘇P. frutescens var. crispa（Thunb.） Hand.-Mazz.、耳齒紫蘇P. frutescens var. auriculato-dentata C. Y. Wu.et Hsuan 和野生紫蘇P. frutescens var. purpurascens（Hayata） H. W. Li[1]。然而由于紫蘇屬植物在我國廣泛人工栽培，屬下不同變種植物的表型特征非常相似，并且表型往往受到植物自身生長周期和外界環(huán)境因素的影響， 從而造成傳統(tǒng)鑒定方法易產(chǎn)生混淆，進(jìn)而危及用藥安全。 另一方面，紫蘇子在加工食品、功能性飲品、保健品及化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸增多， 但產(chǎn)量低不能滿足增長的市場需求量；種苗錯誤種植、混合種植、混合收購、人為摻入等現(xiàn)象屢見不鮮，再加之藥用紫蘇子經(jīng)過炮制后外觀特征丟失，常有急性子、沙苑子、白芥子、油菜子和菟絲子等種子混入， 從而造成傳統(tǒng)方法對紫蘇子與其混偽品的鑒別困難[5-6]。

DNA 條形碼（DNA barcoding）技術(shù)是利用生物基因組上一段具有足夠變異， 且易于PCR 擴(kuò)增的片段，可用來區(qū)分不同物種的分子生物學(xué)技術(shù)，是對傳統(tǒng)物種鑒定方法的有效補(bǔ)充[7]。 其中ITS2（Internal transcribed spacer 2）條形碼在植物分類鑒別中的穩(wěn)定性和適用性已得到廣泛驗(yàn)證[8-11]。 ITS2片段位于5.8S 和28S 核rDNA 基因之間。 rDNA 轉(zhuǎn)錄形成rRNA，RNA 的一級結(jié)構(gòu)是指A、U、C、G 4 種核苷酸的排列組合；RNA 的二級結(jié)構(gòu)是指其自身回折形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，不配對堿基構(gòu)成環(huán)區(qū)，莖干區(qū)由配對堿基構(gòu)成[12-13]；而在莖干區(qū)，有時可發(fā)生補(bǔ)償性堿基替換（Compensatory base changes，簡稱CBC），即為了維持配對結(jié)構(gòu)，一側(cè)堿基發(fā)生突變會引起另一側(cè)堿基的響應(yīng)配對性突變，如C-G 配對中，胞嘧啶C 突變?yōu)橄汆堰蔄， 原配對中的G 相應(yīng)突變?yōu)閁，即由C-G 變化為A-U，從而維持二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 研究表明，發(fā)生CBC 的兩個個體之間存在生殖隔離，CBC 與雜交不親和有很強(qiáng)的相關(guān)性，即ITS2 二級結(jié)構(gòu)中的CBC 是一種對真核生物進(jìn)行分類的有效方法[14-15]。

近年來對紫蘇與其變種的分子鑒別僅停留在核酸序列層面[16]，并且尚無對紫蘇子與其混偽品的DNA 條形碼鑒別研究。 因此作者擬采用ITS2 序列結(jié)合二級結(jié)構(gòu)，對紫蘇與其變種、紫蘇子與其混偽品進(jìn)行分析，為中藥材紫蘇葉與紫蘇子在分子水平上的鑒別提供科學(xué)依據(jù)，保障臨床用藥的合理性和有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究收集紫蘇植物材料3 份，分別來自浙江衢州、陜西西安、桂林全州；白蘇植物1 份，來源于江西贛州； 于GenBank 獲得ITS 序列， 包括紫蘇3條、白蘇10 條、野生紫蘇2 條、回回蘇3 條、耳齒紫蘇3 條、3 個日本紫蘇品種 （文中記為日本紫蘇I、II、III）各1 條、外類群枸骨5 條；共33 份樣本信息見表1。 另外，紫蘇子與其混偽品樣本信息見表2，包括紫蘇子基源植物樣本2 份，分別來源于浙江衢州和陜西西安； 菟絲子和油菜子基源植物樣本各1份， 分別來自廣東茂名和陜西西安；GenBank 下載ITS 序列包括紫蘇子3 條、 急性子4 條、 白芥子5條、沙苑子3 條、菟絲子3 條、油菜子2 條；共24 份樣本。 所有植物材料經(jīng)西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生藥教研室汪興軍老師鑒定，并保存于-80 ℃冰箱。

表1 紫蘇與其變種的材料種類和來源的詳細(xì)資料Table 1 Detailed information of materials types and sources of P. frutescens and its varieties

表2 紫蘇子與其混偽品的材料種類和來源的詳細(xì)資料Table 2 Samples of Perillae fructus and its adulterants

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇擦拭新鮮植物樣本葉或莖的表面， 取約150 mg 組織于1.5 mL 滅菌離心管中，迅速放入液氮中冷凍。 在液氮環(huán)境下，用滅菌小木棒研磨植物組織至粉末狀。 再按照DP305 植物基因組DNA 提取試劑盒說明書操作提取DNA。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增、 測序和校正 選擇ITS2 通用引物進(jìn)行序列擴(kuò)增[17]，ITS2F（5′-ATGCGATACTTGGT GTGAAT-3′）和ITS2R（5′-GACGCTTCTCCAGACT ACAAT-3′）。RCR 反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃45 s，循環(huán)40 次，72 ℃2 min。PCR反應(yīng)體系：DNA 模板1 μL， 引物ITS2F 和ITS2R 各1 μL，DNA 聚合酶2×Taqmix 12.5 μL，ddH2O 補(bǔ)充至25 μL。 PCR 產(chǎn)物由北京擎科澤西生物科技有限公司完成Sanger 測序，每個樣本重復(fù)3 次測序。 通過Contig Express 軟件去除每條序列的兩端引物區(qū)，檢查測序峰圖并進(jìn)行人工校正，最終得到全部序列。

1.2.3 GenBank 序列下載及ITS2 注釋 通過GenBank（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）分別下載紫蘇與其變種、紫蘇子與其各混偽品的ITS 序列，并通過BLAST 相似性搜索排除可疑序列。將所得序列連同測序序列，基于隱馬爾可夫模型HMM[18]除去位于兩端的5.8S 和28S 序列， 得到所有樣本的ITS2 序列。 使用Clustal omega 在線軟件對所有收集到的序列進(jìn)行比對和矯正。

1.2.4 序列分析、 遺傳距離計算及NJ 樹構(gòu)建MEGA7.0 軟件比對序列矩陣，統(tǒng)計GC 含量、保守位點(diǎn)和變異位點(diǎn)等信息； 基于Kimura 2-parameter（K2P）模型計算各物種種內(nèi)和種間遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，設(shè)置參數(shù)Bootstrap 自展支持率1000 次重復(fù)檢驗(yàn)各分支。

1.2.5 ITS2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及PNJ 樹構(gòu)建 利用ITS2 Database （http：//its2.bioapps.biozentrum.uni -wuerzburg.de/）中Predict 功能預(yù)測各物種ITS2 的二級結(jié)構(gòu)。 下載各樣本的核酸序列和二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣，通過4Sale 軟件比對聯(lián)合矩陣，進(jìn)行序列和二級結(jié)構(gòu)的比對。比對完成后對ITS2 一級序列和二級結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行構(gòu)建，4Sale[19]導(dǎo)出的比對結(jié)果輸入ProfDistS[20]軟件，基于距離法利用剖面鄰接Profile neighbor-joining （PNJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并自展分析1000 次來評價分支系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇與其變種ITS2 變異位點(diǎn)分析

紫蘇與其變種的ITS2 序列長度相近， 集中在231 bp 和233 bp。 3 個日本紫蘇品種的ITS2 序列GC 含量較高在81.20%～82.00%， 而紫蘇與其他變種的序列GC 含量為64.20%～65.40%（見表3）。 紫蘇I（序列號KC011247）在123 bp 處有T→G 一個變異位點(diǎn)，即紫蘇種內(nèi)存在2 種單倍型；回回蘇和耳齒紫蘇分別在222 bp 和22 bp 處各有一個變異位點(diǎn)。野生紫蘇在22、103 bp 處發(fā)生變異，共兩個變異位點(diǎn)。白蘇無變異位點(diǎn)。3 個日本紫蘇與其他變種間序列變異較大。 變異位點(diǎn)信息如表4 所示。

表3 紫蘇與其變種的ITS2 序列差異分析Table 3 ITS2 sequence analysis of P. frutescens and its varieties

表4 紫蘇與其變種的變異位點(diǎn)分析Table 4 Variation sites of P. frutescens and its varieties

2.2 紫蘇與其變種遺傳距離分析

基于K2P 模型計算的遺傳距離顯示（見表5），紫蘇的平均種內(nèi)遺傳距離為0.002， 其余各變種的種內(nèi)遺傳距離均為0.000。 白蘇與紫蘇的種間遺傳距離為0.001， 紫蘇的種內(nèi)遺傳距離大于紫蘇與白蘇種間遺傳距離， 因此不能將白蘇和紫蘇區(qū)分開。白蘇、 紫蘇與其他變種種間的遺傳距離為0.005～0.033，大于各物種的種內(nèi)遺傳距離0.000～0.002；即白蘇、紫蘇分別與其他變種及其他各物種（不含構(gòu)骨）的種間最小遺傳距離大于各物種種內(nèi)最大遺傳距離。 因此，從遺傳距離水平，ITS2 序列可將紫蘇、白蘇與其他變種區(qū)分開。

表5 紫蘇與其變種的遺傳距離Table 5 Genetic distance table of P. frutescens and its varieties

2.3 紫蘇與其變種二級結(jié)構(gòu)及CBC 模型分析

紫蘇與其變種的ITS2 二級結(jié)構(gòu)均由一環(huán) （主環(huán)）四臂（螺旋區(qū)）組成（見圖1），并且中心環(huán)和莖臂的夾角在不同物種間較為相近。 其中紫蘇包含3 個內(nèi)環(huán)和4 個發(fā)夾環(huán)，與白蘇、耳齒紫蘇和回回蘇相比在臂IV 上區(qū)少了2 個內(nèi)環(huán)，與野生紫蘇、日本紫蘇I 相比在臂III 和臂IV 區(qū)上各少2 個內(nèi)環(huán)， 與日本紫蘇II 相比，臂IV 區(qū)少了2 個內(nèi)環(huán)。 白蘇包含有4 個發(fā)夾環(huán)和5 個內(nèi)環(huán)，白蘇比野生紫蘇在臂III 區(qū)少1 個內(nèi)環(huán)， 白蘇和耳齒紫蘇的臂IV 區(qū)的內(nèi)環(huán)的位置也不同。 在臂IV 區(qū)處回回蘇的第1 個內(nèi)環(huán)比耳齒紫蘇更靠近中心環(huán)。 回回蘇相比野生紫蘇在臂III 上少1 個內(nèi)環(huán)， 并且臂IV 區(qū)的第1 個內(nèi)環(huán)更靠近中心環(huán)。 即紫蘇與白蘇及其他變種之間，ITS2 二級結(jié)構(gòu)在內(nèi)環(huán)的數(shù)量和位置均存在差異。CBC（補(bǔ)償性堿基替換）模型的統(tǒng)計結(jié)果顯示，回回蘇分別與白蘇、耳齒紫蘇、野生紫蘇在臂Ⅳ區(qū)具有1 個CBC（203/222 T-A→G-C）和1 個hCBC（204/221 T-A→T-G）（見圖2），基于CBC 模型顯示回回蘇分別與白蘇、耳齒紫蘇、野生紫蘇符合雜交不親和現(xiàn)象。 綜上所述，ITS2 二級結(jié)構(gòu)對于紫蘇與其變種的鑒別具有指導(dǎo)意義。

圖1 紫蘇與其變種的ITS2 二級結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 ITS2 secondary structure prediction diagram of P. frutescens and its varieties

圖2 紫蘇與其變種的ITS2 二級結(jié)構(gòu)CBC 模型Fig. 2 CBC of ITS2 secondary structure of P. frutescens and its varieties

2.4 紫蘇與其變種NJ 樹分析

由ITS2 序列構(gòu)建的NJ 樹可以看出，日本紫蘇與我國產(chǎn)紫蘇與其變種明顯區(qū)分開（見圖3）。 從分支情況和支持率可見，紫蘇和白蘇樣本不能有效的區(qū)分開，共聚為一個大分支，二者親緣關(guān)系最近；回回蘇、耳齒紫蘇和野生紫蘇形成姐妹分支，其中野生紫蘇與耳齒紫蘇親緣關(guān)系較近。 冬青科植物枸骨Ilex cornuta 作為外類群。

圖3 紫蘇與其變種的NJ 樹Fig. 3 NJ tree of P. frutescens and its varieties

2.5 紫蘇子與其混偽品的序列和遺傳距離分析

紫蘇子與其混偽品的ITS2 序列差異較大（見表6）， 序列長度在191～233 bp，GC 含量在50.50%～64.90%，物種間也存在大量變異位點(diǎn)。 如表7 所示，基于K2P 模型計算紫蘇子與其混偽品的遺傳距離，急性子、白芥子、油菜子種內(nèi)遺傳距離均為0.000，紫蘇子種內(nèi)平均遺傳距離為0.003， 種內(nèi)最大遺傳距離的是混偽品沙苑子0.013。 種間最小遺傳距離是白芥子和沙苑子0.627； 紫蘇子與其混偽品白芥子的遺傳距離最小，而紫蘇子與其混偽品菟絲子的遺傳距離最大。所有物種的種間最小遺傳距離（0.627）大于種內(nèi)最大遺傳距離（0.013），并且紫蘇子與其混偽品的種間最小遺傳距離（0.634）遠(yuǎn)大于紫蘇子種內(nèi)遺傳距離， 表明基于K2P 遺傳距離，ITS2 序列能夠區(qū)分紫蘇子與其混偽品（急性子、沙苑子、白芥子、菟絲子和油菜子）。

表6 紫蘇子與其混偽品的ITS2 序列分析Table 6 ITS2 sequence analysis of Perillae fructus and its adulterants

表7 紫蘇子與其混偽品的遺傳距離Table 7 Genetic distance table of Perillae fructus and its adulterants

2.6 紫蘇子與其混偽品的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析

紫蘇子與其混偽品的二級結(jié)構(gòu)符合被子植物一環(huán)（主環(huán)）四臂（螺旋區(qū)）的特征，其中臂III 最長，臂IV 變異最大，其次是臂I，臂II 最保守，螺旋上又有大小和數(shù)量不等的莖環(huán)（見圖4）。 紫蘇子與其混偽品在環(huán)的大小和位置、旋臂的角度上均有較大區(qū)別，其中急性子、沙苑子、白芥子和油菜子在臂I 和臂IV 之間有一段富含嘌呤的單鏈結(jié)構(gòu)。 因此ITS2二級結(jié)構(gòu)對紫蘇子與其混偽品的物種鑒別具有一定的參考價值。

圖4 紫蘇子與其混偽品的ITS2 二級結(jié)構(gòu)圖Fig. 4 Prediction diagram of ITS2 secondary structure of Perillae fructus and its adulterants

2.7 紫蘇子與其混偽品的NJ 樹、PNJ 樹分析

由紫蘇子與其混偽品的NJ 樹中可見， 紫蘇子單獨(dú)聚為一支，支持率高達(dá)99%，表現(xiàn)出良好的單系性（見圖5）。常見混偽品沙苑子、白芥子、急性子、菟絲子和油菜子也分別聚為一支。ITS2 一級序列與二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣構(gòu)建PNJ 樹顯示，各物種均能分支區(qū)分開與NJ 樹結(jié)果吻合，并且PNJ 樹結(jié)果比NJ樹顯示出更多的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系信息位點(diǎn)。

圖5 紫蘇子與其混偽品的NJ 樹和PNJ 樹Fig. 5 NJ tree and PNJ tree of Perillae fructus and its adulterants

3 結(jié)語

我國是紫蘇的原產(chǎn)地，紫蘇具有很高的食用價值和藥用價值，是藥食同源的代表植物。 紫蘇作為食材是美味的天然調(diào)味品，早在兩漢時期，已有將活鯉魚切成生魚片搭配紫蘇食用，既可去腥又可保持魚肉的鮮美。 并且紫蘇在我國用藥歷史悠久，紫蘇葉、 紫蘇梗和紫蘇子被收錄為3 種不同藥材，分別具有治療風(fēng)寒感冒、調(diào)節(jié)腸胃、促進(jìn)氣血循環(huán)、減輕疼痛、解咳嗽和氣喘、緩解便秘的作用。 另外，詩經(jīng)中“荏染柔木，君子樹之”，已經(jīng)用紫蘇指代人們美好的情感，后更用“荏苒冬春謝，寒暑忽流易”，將紫蘇與流逝的時光聯(lián)系起來。 可見，對中國人來說，紫蘇不僅是一種食物、一種藥材，更是一種中國文化精神象征。

紫蘇屬下變種多，且變種易受到環(huán)境因素的影響而改變，品種的鑒定依賴于具備植物學(xué)和生藥學(xué)等專業(yè)知識且經(jīng)驗(yàn)豐富的學(xué)者。 近年來，我國紫蘇市場銷勢活躍，產(chǎn)銷兩旺，批量成交增加，出口訂單上升。 而前幾年我國紫蘇產(chǎn)量少，市場供應(yīng)缺口逐年加大，短期難以緩解，紫蘇的緊缺已使價格大幅上漲，導(dǎo)致市面上出現(xiàn)紫蘇子與其混偽品、紫蘇與其變種存在不合理的銷售問題。

作者采用ITS2 序列以及二級結(jié)構(gòu)分別對紫蘇與其變種、紫蘇子與其混偽品進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示，僅僅依靠ITS2 序列不能將紫蘇與白蘇兩個種區(qū)分開， 但二者的ITS2 二級結(jié)構(gòu)存在內(nèi)環(huán)數(shù)量的差異；紫蘇、白蘇分別與其他變種均可有效區(qū)分，符合種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離。 在ITS 序列、K2P 遺傳距離、ITS2 二級結(jié)構(gòu)、 基于序列的NJ樹和基于一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)聯(lián)合矩陣的PNJ 樹均顯示紫蘇子與其混偽品可以明顯區(qū)分。 因此，建議ITS2 可以作為紫蘇子與其混偽品的DNA 條形碼，而對紫蘇與白蘇的鑒別或建議合并的假設(shè)還有待進(jìn)一步研究。