維氏氣單胞菌來(lái)源幾丁質(zhì)酶的克隆表達(dá)及應(yīng)用

魯夢(mèng)唯， 陳 晟， 吳 敬*

（1. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

豐年蝦（Artemia salina L.），俗稱鹵蟲(chóng)，是一種小型甲殼類(lèi)動(dòng)物，常見(jiàn)于高鹽度水域，物種多樣性低且結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單[1]。 其繁殖能力和休眠卵抗逆性強(qiáng)[2]，孵化時(shí)間短，18～30 h 即可孵化成無(wú)節(jié)幼蟲(chóng)[3]。孵化后的幼蟲(chóng)含有豐富的蛋白質(zhì)，常用作水產(chǎn)動(dòng)物的餌料[4]，而孵化殘留的卵殼屬于廢棄物。 研究表明，豐年蝦卵殼含有豐富的蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)[5-6]，以豐年蝦卵殼為原料制備幾丁寡糖， 不僅成本低廉，還能廢物利用，具有極大的應(yīng)用價(jià)值。

幾丁寡糖是幾丁質(zhì)酶（EC 3.2.1.14）通過(guò)斷裂幾丁質(zhì)鏈中的α-1，4-糖苷鍵生成的產(chǎn)物，不僅能作為一種天然食品防腐劑來(lái)抑制腐敗菌滋生，還具有較好的抗氧化性和保濕性，能有效延緩衰老，在功能性食品領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力[7-9]。 孫文敏等利用化學(xué)法以豐年蝦卵殼為原料制備幾丁寡糖[1]；黃曉燕采用酸堿法，以豐年蝦卵殼為原料制得了食品級(jí)幾丁質(zhì)[10]。Yosefali 等采用將豐年蝦卵殼和多種細(xì)菌共培養(yǎng)的方法提取幾丁寡糖，能獲得較高的產(chǎn)率和純度[11]。

鑒于傳統(tǒng)化學(xué)法存在環(huán)境污染嚴(yán)重且成本較高等缺點(diǎn)[12-13]，以豐年蝦卵殼為原料，采用生物酶法制備幾丁寡糖具有極大的應(yīng)用潛力。 豐年蝦卵殼的主要成分為蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)，其中卵殼幾丁質(zhì)因受到蛋白質(zhì)包裹導(dǎo)致其暴露在外的結(jié)合位點(diǎn)較少，因此添加中性蛋白酶對(duì)豐年蝦卵殼進(jìn)行蛋白質(zhì)脫除處理后再使用幾丁質(zhì)酶水解，理論上能獲得較高的幾丁寡糖的回收率[14]。 作者采用高效且環(huán)境友好的生物酶法，以豐年蝦卵殼為原料有效制備出具有抗氧化性能的幾丁寡糖。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

攜帶幾丁質(zhì)酶ChiB565 基因的質(zhì)粒pPIC9KChiB565：蘇州金唯智生物科技有限公司合成；菌株P(guān)ichia pastoris GS115：作者所在實(shí)驗(yàn)室前期保藏；豐年蝦卵殼：山東省濰坊市浩海水產(chǎn)飼料有限公司產(chǎn)品；酵母粉、蛋白胨：英國(guó)Oxoid 公司產(chǎn)品；中性蛋白酶：北京夏盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DPPH、ABTS：上海阿拉丁試劑有限公司產(chǎn)品；其他國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┚?gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

YPD 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。

MD 培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，YNB 13.4，生物素4×10-4，瓊脂粉15。

BMMY 培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 10，YNB 13.4，胰蛋白胨20，生物素4×10-4。

BMGY培養(yǎng)基（g/L）：酵母提取物 10，YNB 13.4，胰蛋白胨20，甘油10，生物素4×10-4。

種子培養(yǎng)基（g/L）：甘油30，酵母提取物10，胰蛋白胨20，YNB 13.4。

BSM 培養(yǎng)基：甘油40 g/L，MgSO4·7H2O 14.9 g/L，CaSO4·2H2O 0.94 g/L，KOH 0.83 g/L，K2SO418.2 g/L，KH2PO46 g/L，PTM 4.32 mL/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油500 g/L，PTM 5 mL/L。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：甲醇，PTM 12 mL/L。

PTM 培 養(yǎng) 基 （g/L）： 生 物 素0.2，ZnCl220，F(xiàn)eSO4·7H2O 65，CuSO4·5H2O 6，MnSO4·H2O 3，CoCl20.5，KI 0.08，Na2MoO3·2H2O 0.2，H3BO30.02，H2SO45。

1.2 儀器與設(shè)備

小型高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；分析電子天平：瑞士Mettler-Toledo 公司產(chǎn)品；烘箱和恒溫振蕩培養(yǎng)箱： 上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)、Mini Protein 3 蛋白電泳系統(tǒng)： 美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品；3 L 全自動(dòng)發(fā)酵罐： 荷蘭Applicon 公司產(chǎn)品； 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)： 日本Shimadzu 公司產(chǎn)品；色譜柱：安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；Waters e2695 系統(tǒng)：Waters 科技（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組菌P. pastoris GS115/pPIC9K-ChiB565的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選 將合成得到的質(zhì)粒pPIC9K-ChiB565 經(jīng)Sac I 線性化后， 在1500 V 條件下電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入已制備好的P. pastoris GS115 感受態(tài)細(xì)胞，迅速加入1 mL 1 mol/L 的山梨醇，吹吸混勻后于30 ℃復(fù)蘇2 h。 隨后取200 μL 菌液均勻涂布到MD 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至長(zhǎng)出可見(jiàn)的單菌落。 挑取單菌落經(jīng)抗性平板篩選、搖瓶篩選后測(cè)定菌液的OD600和上清液的幾丁質(zhì)酶活性，OD600和幾丁質(zhì)酶活性較高的即為畢赤酵母的高拷貝轉(zhuǎn)化子。

1.3.2 重組菌P. pastoris GS115/pPIC9K-ChiB565 的培養(yǎng)方法

1）搖瓶發(fā)酵 將重組菌P. pastoris GS115/pPIC9K-ChiB565 的高拷貝轉(zhuǎn)化子菌液以體積分?jǐn)?shù)0.2%的接種率接入10 mL YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h。 再以體積分?jǐn)?shù)0.2%的接種率接入100 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 培養(yǎng)24 h。 隨后將菌液在4 ℃、5000 g 離心10 min后，棄去上清液，用50 mL BMMY 培養(yǎng)基復(fù)溶，同時(shí)添加375 μL 純甲醇誘導(dǎo)。 菌液于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，且每24 h 補(bǔ)加250 μL 的純甲醇誘導(dǎo)，共培養(yǎng)4～6 d。

2）種子培養(yǎng) 取保藏于-80 ℃的甘油管在YPD培養(yǎng)基上劃線活化，挑取生長(zhǎng)良好的單菌落接種于100 mL 的種子培養(yǎng)基中， 在30 ℃、200 r/min 的條件下培養(yǎng)24 h 獲得種子液。

3）3 L 罐發(fā)酵 將培養(yǎng)24 h 的種子液全部接入已滅菌的0.9 L 發(fā)酵培養(yǎng)基中， 通過(guò)流加體積分?jǐn)?shù)為30%氨水調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)的pH，使發(fā)酵過(guò)程pH穩(wěn)定在5.0 左右； 同時(shí)設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速與通氣進(jìn)行結(jié)合， 使發(fā)酵過(guò)程的溶氧維持在不超過(guò)30%； 待第1次溶氧反彈后，開(kāi)始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。 繼續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)12～14 h 后，停止補(bǔ)料，饑餓處理1 h，此時(shí)取樣測(cè)量， 控制OD600在130 左右或濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到30%，并調(diào)節(jié)發(fā)酵罐溫度至28 ℃；待溶氧明顯回升且溫度穩(wěn)定后，開(kāi)始甲醇誘導(dǎo)，按菌體實(shí)際生長(zhǎng)狀況逐漸提高甲醇流量；甲醇誘導(dǎo)階段可每12 h 間歇停止補(bǔ)加甲醇，觀察溶氧反彈情況以確保甲醇并未過(guò)量，待發(fā)酵酶活不再上升時(shí)終止發(fā)酵。 其中甲醇誘導(dǎo)速度采用分階段恒流補(bǔ)加甲醇的方法。

1.3.3 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的酶學(xué)性質(zhì)研究

1）最適溫度 在pH 5.0 下，分別測(cè)定等量重組酶液在不同溫度（20～70 ℃）條件下的酶活，定義最高酶活為100%， 計(jì)算不同溫度條件下的相對(duì)酶活（殘留酶活）。

2）溫度穩(wěn)定性 將重組酶液放置于37、50、60 ℃中，定時(shí)取樣測(cè)其酶活。定義0 h 的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活（殘留酶活）。

3）最適pH 分別在不同pH 條件下（pH 3.0～9.0）測(cè)定酶活，定義最高點(diǎn)酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活（殘留酶活）。

4）pH 穩(wěn)定性 在50 ℃條件下， 將一定量的重組酶液分別于pH 3.0～9.0 的緩沖液中孵育2 h 后測(cè)定酶活（殘留酶活）。

1.3.4 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的活性檢測(cè) 幾丁質(zhì)酶活性采用DNS 法[15]進(jìn)行測(cè)定。 在50 ℃、pH 5.0條件下，以250 μL 的10 g/L 膠體幾丁質(zhì)為底物，添加100 μL 的重組幾丁質(zhì)酶粗酶液和150 μL 的20 mmol/L 磷酸檸檬酸鹽緩沖液，精準(zhǔn)反應(yīng)1 h，再添加2 mL 的DNS 終止反應(yīng)， 隨后立即煮沸5 min 再冷卻至室溫，在12000 g 下離心5 min，測(cè)量上清液于540 nm 的吸光度。 根據(jù)乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的DNS 顯色標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。幾丁質(zhì)酶活性的定義為在50 ℃條件下， 每小時(shí)釋放出1 μmol 的GlcNAc 所需的酶量，即為一個(gè)單位酶活。

1.3.5 豐年蝦卵殼成分分析 取足量豐年蝦卵殼充分研磨壓碎并過(guò)50 目篩得到卵殼粉末。 卵殼水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定參照 《飼料水分的測(cè)定方法》（GB 6435—86）中方法，在90 ℃下卵殼粉末干燥2 h 后準(zhǔn)確稱質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定；卵殼灰分按照《飼料中粗灰分的測(cè)定》（GB 6438—2007）中燃燒法測(cè)定；準(zhǔn)確稱量1.00 g 卵殼粉末在20 mL 1 mol/L 的NaOH 中于40 ℃充分?jǐn)嚢? h，運(yùn)用《油料粗蛋白質(zhì)的測(cè)定法》（GB/T 14489.2—1993）中凱氏定氮法測(cè)量上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)確定卵殼蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)；將上一步殘留的沉淀置于20 mL 1 mol/L 的HCl 在25 ℃下充分?jǐn)嚢? h， 去除上清液并充分洗滌干燥殘余沉淀并稱質(zhì)量，記錄為卵殼幾丁質(zhì)質(zhì)量。

1.3.6 豐年蝦卵殼蛋白質(zhì)的脫除

1）中性蛋白酶加酶量?jī)?yōu)化 在1.3.5 研磨得到的卵殼粉末中加入50 mmol/L 磷酸緩沖液配置成10 g/dL 的反應(yīng)底物，設(shè)置中性蛋白酶加酶量為10、20、30、40、50、60 mg/g（以底物質(zhì)量計(jì)），在50 ℃、pH 5.0 條件下振蕩培養(yǎng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后在12000 g 下離心5 min，保留沉淀并稱質(zhì)量。

2）水解時(shí)間優(yōu)化 將反應(yīng)底物置于最適中性蛋白酶加酶量下相同條件反應(yīng)1、2、3、4、5、6 h 后與上一步相同條件離心，保留沉淀并稱質(zhì)量。

式中：I 為蛋白質(zhì)脫除率，%，A1為卵殼粉底物質(zhì)量，g；A2為殘留沉淀質(zhì)量，g；A0為底物卵殼粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.7 豐年蝦卵殼幾丁質(zhì)的水解

1）重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 加酶量?jī)?yōu)化 將1.3.6 得到的沉淀加入50 mmol/L 磷酸緩沖液配置成10 g/dL 的反應(yīng)底物，設(shè)置重組幾丁質(zhì)酶ChiB565加 酶 量 為10、20、30、40、50、60 U/g （以 底 物 質(zhì) 量計(jì)），在50 ℃、pH 5.0 條件下振蕩培養(yǎng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后在12000 g 離心5 min，保留沉淀并稱質(zhì)量。

2）水解時(shí)間優(yōu)化 將反應(yīng)底物置于最適重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 加酶量下相同條件反應(yīng)1、2、3、4、5、6 h 后離心對(duì)沉淀稱質(zhì)量， 同時(shí)保留上清液以備后續(xù)檢測(cè)。

式中：W 為幾丁質(zhì)回收率，%；B1為沉淀底物質(zhì)量，g；B2為殘留沉淀質(zhì)量，g；B0為沉淀底物中幾丁質(zhì)質(zhì)量，g。

1.3.8 豐年蝦卵殼水解產(chǎn)物成分測(cè)定 1.3.7 所得上清液即為豐年蝦卵殼幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物，通過(guò)DNS法測(cè)定水解產(chǎn)物的總還原糖。 水解產(chǎn)物中組成成分通過(guò)HPLC 測(cè)定。 將水解產(chǎn)物用乙腈稀釋并過(guò)濾膜（0.22 μm）得到樣品，以體積分?jǐn)?shù)為75%乙腈為流動(dòng)相，在30 ℃和0.8 mL/min 流量下，將樣品進(jìn)樣于HPLC 系統(tǒng)（Separations module），采用Hypersil APS色譜柱（250 mm×4.6 mm）進(jìn)行產(chǎn)物分析。

1.3.9 豐年蝦卵殼水解產(chǎn)物抗氧化性測(cè)定 DPPH自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]，ABTS 自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 豐年蝦卵殼水解酶的選擇

對(duì)豐年蝦卵殼的成分進(jìn)行分析，經(jīng)檢測(cè)豐年蝦卵殼中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58.92%，幾丁質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.18%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.44%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.51%。 鑒于豐年蝦卵殼中蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，因此選擇以中性蛋白酶和幾丁質(zhì)酶協(xié)同處理對(duì)豐年蝦卵殼進(jìn)行水解以獲得幾丁寡糖。 由于中性蛋白酶商品化程度較高，且具有較為廣泛的底物親和性和較高的比酶活，因此選用商品中性蛋白酶進(jìn)行處理。

豐年蝦卵殼中存在的天然幾丁質(zhì)一般以結(jié)晶形式存在。 研究表明， 幾丁質(zhì)結(jié)合域CBD（Chitin binding domain）的存在能高效促進(jìn)幾丁質(zhì)酶對(duì)晶體幾丁質(zhì)的水解[18]。相關(guān)研究表明，幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)生成產(chǎn)物大多為幾丁四糖以下的寡糖[19-20]，而聚合度較高的幾丁寡糖具有更好的生物活性。 因此，選擇維氏氣單胞菌來(lái)源的幾丁質(zhì)酶ChiB565， 其具備GH18 家族典型的催化結(jié)構(gòu)域和CBD 結(jié)構(gòu)域[21]，對(duì)晶體幾丁質(zhì)催化效率高，且同時(shí)具有內(nèi)切和外切活性，水解速度快；其水解蝦殼幾丁質(zhì)產(chǎn)物為幾丁二糖到幾丁六糖，無(wú)論是從水解效率還是水解產(chǎn)物分布角度，理論上都應(yīng)對(duì)豐年蝦卵殼具有較好的水解效果。

2.2 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 在P. pastoris 中的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

將合成得到的質(zhì)粒pPIC9K-ChiB565 電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入P. pastoris GS115 的感受態(tài)細(xì)胞中， 經(jīng)過(guò)抗性平板篩選和搖瓶篩選對(duì)重組菌進(jìn)行高拷貝轉(zhuǎn)化子篩選，結(jié)果顯示，重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 水解膠體幾丁質(zhì)的酶活為3.40 U/mL。 通過(guò)SDS-PAGE 分析（見(jiàn)圖1）， 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小約為114800。

圖1 重組菌P. pastoris GS115/pPIC9K-ChiB565 轉(zhuǎn)化子的SDS-PAGE 分析Fig. 1 SDS -PAGE analysis of recombinant strain P.pastoris GS115/pPIC9K-ChiB565 transformant

如圖2（a）和（b）所示，在20～70 ℃條件下，重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 最適溫度為50 ℃。 在37 ℃條件下孵育90 min，重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的相對(duì)酶活（殘留酶活）仍有90%；在50 ℃孵育90 min，重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的相對(duì)酶活為70%； 而當(dāng)在60 ℃孵育10 min 時(shí)，重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 相對(duì)酶活迅速降低至40%，孵育90 min 后相對(duì)酶活僅為20%。如圖2（c）和（d）所示，在pH 3.0～9.0 條件下，重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的最適pH 為5.0。 在pH 5.0 條件下，孵育2 h 后相對(duì)酶活最高，在pH 4.0～7.0 孵育2 h 后殘留酶活都不低于最高值的80%，pH 穩(wěn)定性較好。

圖2 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的酶學(xué)性質(zhì)Fig. 2 Enzymatic properties of recombinant chitinase ChiB565

2.3 重組菌P. pastoris GS115/pPIC9K-ChiB565的發(fā)酵優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源優(yōu)化 在BSM 培養(yǎng)基中添加40 g/L 的無(wú)機(jī)氮源（NH4）2HPO4，進(jìn)行3 L 罐發(fā)酵，菌體濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)和發(fā)酵上清液的酶活曲線如圖3 所示。 結(jié)果顯示整個(gè)發(fā)酵周期內(nèi)，添加無(wú)機(jī)氮源組的菌體濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于未添加無(wú)機(jī)氮源組，并且發(fā)酵酶活也均高于未添加無(wú)機(jī)氮源組。 其中在誘導(dǎo)120 h 時(shí)， 添加無(wú)機(jī)氮源組的最高酶活為11.8 U/mL， 是未添加無(wú)機(jī)氮源組最高酶活的1.37倍。 上述結(jié)果表明，添加無(wú)機(jī)氮源能有效促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，提高重組菌的發(fā)酵酶活。

圖3 培養(yǎng)基中氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)及酶活的影響Fig. 3 Effect of nitrogen source in medium on P. pastoris growth and enzyme activity

2.3.2 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化 由于P. pastoris 的最適生長(zhǎng)溫度在28～30 ℃， 同時(shí)低溫條件有益于蛋白質(zhì)折疊，因此設(shè)置20、25、28 ℃溫度梯度進(jìn)行上罐優(yōu)化。發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)和發(fā)酵上清液酶活曲線如圖4 所示。 在誘導(dǎo)0～24 h 階段，3 個(gè)溫度下菌體濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)明顯差別； 在誘導(dǎo)24 h 后，菌體進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段，菌體濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨誘導(dǎo)溫度的升高而升高。 發(fā)酵酶活結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)溫度的升高，重組幾丁質(zhì)酶活性也隨之升高。 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28 ℃時(shí)， 誘導(dǎo)120 h 后酶活達(dá)到最高，為11.9 U/mL，是搖瓶酶活的3.5 倍；當(dāng)誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，同期發(fā)酵酶活始終低于28 ℃，且誘導(dǎo)96 h 酶活開(kāi)始下降。

圖4 20、25、28 ℃誘導(dǎo)溫度下重組菌生長(zhǎng)及重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 表達(dá)情況Fig. 4 Growth of recombinant bacteria and expression of recombinant chitinase ChiB565 at induction temperature of 20，25，28 ℃

由上述結(jié)果分析可知， 雖然在20 ℃低溫條件下有益于蛋白質(zhì)折疊， 但此時(shí)菌體生長(zhǎng)速率也較緩，同時(shí)重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 的積累會(huì)破壞菌體細(xì)胞壁，限制菌體生長(zhǎng)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)，最終導(dǎo)致菌體量較少，酶活較低；而28 ℃誘導(dǎo)時(shí)，菌體生長(zhǎng)速率較快，在發(fā)酵前、中期受到甲醇細(xì)胞毒性的影響較小，菌體得以快速積累，更利于其在發(fā)酵后期減小甲醇毒性以及重組幾丁質(zhì)酶ChiB565對(duì)菌體的降解，從而提高酶活。 結(jié)果表明，誘導(dǎo)溫度設(shè)置為28 ℃將有利于前期菌體的生長(zhǎng)和后期蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2.3.3 誘導(dǎo)補(bǔ)料條件優(yōu)化 P. pastoris 在誘導(dǎo)階段以甲醇作為生長(zhǎng)碳源，生長(zhǎng)速率較低，相關(guān)研究表明此階段使用復(fù)合碳源補(bǔ)料可以提高菌體生長(zhǎng)速率，并減小甲醇對(duì)菌體生長(zhǎng)造成的影響。 本研究中選擇在誘導(dǎo)中期48 h 開(kāi)始以甲醇誘導(dǎo)速度的10%進(jìn)行甘油補(bǔ)料，在誘導(dǎo)溫度28 ℃條件下，發(fā)酵過(guò)程菌體生長(zhǎng)及發(fā)酵酶活曲線如圖5 所示。 濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果顯示， 在誘導(dǎo)48 h 前由于均未添加甘油，濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)較大差異， 當(dāng)48 h 后添加甘油補(bǔ)料后，菌體濕菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于對(duì)照組（不添加甘油補(bǔ)料）。 酶活結(jié)果顯示，當(dāng)不添加甘油補(bǔ)料時(shí)，酶活在誘導(dǎo)120 h 達(dá)到最高，為11.9 U/mL；添加甘油補(bǔ)料后，酶活在132 h 達(dá)到最高，為13.2 U/mL，是不添加甘油補(bǔ)料組最高酶活的1.11 倍， 是搖瓶酶活的3.88 倍。 發(fā)酵上清液的SDS-PAGE 如圖6 所示。 由上述結(jié)果分析可知，發(fā)酵中期添加甘油補(bǔ)料可以緩解菌體受細(xì)胞毒性的影響， 從而促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，同時(shí)還能促進(jìn)蛋白質(zhì)的表達(dá)，提高發(fā)酵液酶活。 結(jié)果表明，誘導(dǎo)階段進(jìn)行甘油補(bǔ)料能有效促進(jìn)菌體生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)表達(dá)。

圖5 誘導(dǎo)階段補(bǔ)加甘油對(duì)重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of supplementation of glycerol on recombinant chitinase ChiB565 expression in the induction phase

圖6 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 發(fā)酵表達(dá)的SDS-PAGE 分析Fig. 6 SDS -PAGE analysis of recombinant chitinase ChiB565 expression

2.4 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 在制備幾丁寡糖中的應(yīng)用

2.4.1 中性蛋白酶脫除豐年蝦卵殼蛋白質(zhì)的加酶量和水解時(shí)間優(yōu)化 為充分脫除卵殼中的蛋白質(zhì)，選擇以蛋白質(zhì)脫除率為指標(biāo)對(duì)中性蛋白酶加酶量和水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。 中性蛋白酶加酶量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖7（a）所示，隨著中性蛋白酶加酶量增加，蛋白質(zhì)脫除率不斷上升，當(dāng)中性蛋白酶加酶量為30 mg/g時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到峰值，約為41.75%，且此時(shí)當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率不再上升。 中性蛋白酶水解時(shí)間優(yōu)化結(jié)果如圖7（b）所示，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)脫除率不斷上升，當(dāng)水解時(shí)間為4 h 時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到峰值，約為50.13%，且此時(shí)當(dāng)水解時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，蛋白質(zhì)脫除率不再上升。因此選擇30 mg/g 加酶量和4 h 水解時(shí)間來(lái)脫除蛋白質(zhì)。

圖7 中性蛋白酶脫除卵殼蛋白質(zhì)的條件優(yōu)化Fig. 7 Optimization of conditions for removing eggshell protein by protease

以豐年蝦卵殼為底物制備幾丁寡糖的研究，卵殼蛋白質(zhì)的脫除通常采用酸堿法，其蛋白質(zhì)脫除率能達(dá)80%以上，但環(huán)境污染嚴(yán)重且作用時(shí)間長(zhǎng)[10]。而全酶法脫除蛋白質(zhì)尚未見(jiàn)報(bào)道，作者采用中性蛋白酶處理豐年蝦卵殼， 較優(yōu)條件下蛋白質(zhì)脫除率為50.13%， 理論上能打開(kāi)幾丁質(zhì)-蛋白質(zhì)的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，在后續(xù)處理中能提高幾丁質(zhì)酶和卵殼幾丁質(zhì)的結(jié)合效率，從而獲得更高幾丁質(zhì)回收率。

2.4.2 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 水解豐年蝦卵殼的加酶量和水解時(shí)間優(yōu)化 為獲得更多的幾丁寡糖，選擇以幾丁質(zhì)回收率為指標(biāo)對(duì)重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 加酶量和水解時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。 加酶量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖8（a）所示，隨著加酶量增加，幾丁質(zhì)回收率不斷上升，當(dāng)加酶量為40 U/g 時(shí)，幾丁質(zhì)回收率達(dá)到峰值，為42.01%，且此時(shí)當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí)，幾丁質(zhì)回收率不再上升。 水解時(shí)間優(yōu)化結(jié)果如圖8（b）所示，隨著水解時(shí)間延長(zhǎng)，幾丁質(zhì)回收率不斷上升，當(dāng)水解時(shí)間為5 h 時(shí)，幾丁質(zhì)回收率達(dá)到峰值，約為60.17%，且此時(shí)當(dāng)水解時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，幾丁質(zhì)回收率不再上升。 因此選擇40 U/g 加酶量和5 h水解時(shí)間來(lái)回收幾丁質(zhì)。

圖8 重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 回收卵殼幾丁質(zhì)的條件優(yōu)化Fig. 8 Optimization of recovering conditions for eggshell chitin by recombinant chitinase ChiB565

在最適條件下，豐年蝦卵殼制備幾丁質(zhì)的回收率為60.17%，結(jié)果表明大多數(shù)豐年蝦卵殼被轉(zhuǎn)化為可溶性幾丁寡糖。 幾丁質(zhì)水解產(chǎn)物中總還原糖質(zhì)量濃度為14.26 g/L，占蝦殼幾丁質(zhì)的58.97%，與幾丁質(zhì)回收率相近。

傳統(tǒng)酸堿法制備幾丁寡糖， 酸堿法分步處理6.5 h 后幾丁質(zhì)回收率為15%，當(dāng)引入微波提取和乙醇浸泡分步處理2 h 后，幾丁質(zhì)回收率能達(dá)到60%[10]。作者采用全酶法處理豐年蝦卵殼， 處理5 h 時(shí)幾丁質(zhì)得率為60.17%，與傳統(tǒng)方法處于同一水平，處理過(guò)程環(huán)境污染較少，處理時(shí)間更短。

2.4.3 豐年蝦卵殼水解產(chǎn)物的成分測(cè)定及抗氧化性分析 豐年蝦卵殼水解產(chǎn)物的HPLC 結(jié)果如圖9所示，共觀察到3 個(gè)較為明顯的特征峰1、2、3，分別對(duì)應(yīng)幾丁二糖、幾丁三糖和幾丁四糖，同時(shí)還觀察到4 個(gè)較小的特征峰4、5、6、7， 其中特征峰4、5 分別對(duì)應(yīng)幾丁五糖和幾丁六糖；由于市面上無(wú)法買(mǎi)到六糖以上的幾丁寡糖標(biāo)準(zhǔn)品，所以無(wú)法確定特征峰6、7 為何種產(chǎn)物。 結(jié)果表明豐年蝦卵殼水解主產(chǎn)物為幾丁二糖到幾丁四糖，同時(shí)伴隨少量幾丁五糖和幾丁六糖。

圖9 豐年蝦卵殼水解產(chǎn)物的HPLC 分析Fig. 9 HPLC analysis of the hydrolysate of Artemia salina eggshells

幾丁寡糖因具有抗氧化能力，在食品保鮮領(lǐng)域中有巨大的應(yīng)用價(jià)值。 豐年蝦卵殼幾丁質(zhì)水解的產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率分別為59.94%和53.15%。這是由于水解生成的不同聚合度殼聚糖產(chǎn)物中的羥基和氨基均可與羥自由基發(fā)生水合反應(yīng)， 另外其氨基可與羥自由基發(fā)生電子置換，進(jìn)而生成穩(wěn)定的電子對(duì)復(fù)合物。 同時(shí)，張振婷等的研究表明低相對(duì)分子質(zhì)量的殼聚糖對(duì)DPPH 自由基具有較強(qiáng)的清除能力[22]，本研究水解產(chǎn)物中存在大量的幾丁二糖，這可能是導(dǎo)致其對(duì)DPPH 自由基的清除率略高于ABTS 自由基的原因。

3 結(jié)語(yǔ)

作者首先在P. pastoris 中重組表達(dá)了幾丁質(zhì)酶ChiB565，研究了其酶學(xué)性質(zhì)并完成了高密度發(fā)酵，隨后以中性蛋白酶和重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 協(xié)同處理豐年蝦卵殼，以制備幾丁寡糖。 結(jié)果顯示當(dāng)先用中性蛋白酶以30 mg/g 的加酶量和4 h 水解時(shí)間處理豐年蝦卵殼以脫除蛋白質(zhì)，再用重組幾丁質(zhì)酶ChiB565 以40 U/g 加酶量和5 h 水解時(shí)間來(lái)水解幾丁質(zhì)時(shí)， 水解產(chǎn)物主要為幾丁二糖到幾丁四糖，伴隨少量幾丁五糖和幾丁六糖； 同時(shí)水解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基和ABTS 自由基清除率分別為59.94%和53.15%。結(jié)果表明該生物酶法以豐年蝦卵殼為底物制備幾丁寡糖相較于傳統(tǒng)化學(xué)法回收率相當(dāng)，且污染較少，處理時(shí)間更短。 該研究采用生物酶法以豐年蝦卵殼為原料有效制備幾丁寡糖，為幾丁寡糖的工業(yè)化制備提供依據(jù)和參考。