達(dá)格列凈改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠斑塊的作用機(jī)制

方 巖，張唯薇，蔣夢(mèng)婷，宋 玲，劉 杰，易 麗，李 泱，高 磊

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 心血管病醫(yī)學(xué)部，北京 100853；3 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 心內(nèi)科，北京 100853

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是引起冠心病的重要原因，合并糖尿病(diabetes mellitus，DM)的冠心病患者血運(yùn)重建獲益低，主要不良心血管事件發(fā)生率高，是棘手的臨床問(wèn)題[1-2]。降糖藥是治療糖尿病的重要手段，但傳統(tǒng)降糖藥缺乏心血管保護(hù)作用。鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2(sodiumglucose cotransporter-2，SGLT2)抑制劑作為新型降糖藥，因在心血管方面的獨(dú)特保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注。尤其是DECLARE系列研究，揭示了SGLT2抑制劑達(dá)格列凈在糖尿病和非糖尿病人群中都有保護(hù)作用[3]。SGLT2抑制劑的主要藥理作用是抑制葡萄糖在腎的再吸收，促進(jìn)葡萄糖排泄[4]。除此之外，抑制血管炎癥、減少氧化應(yīng)激、減少泡沫細(xì)胞形成等也是其改善AS的潛在方式[5-6]，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有研究表明，SGLT2抑制劑可以降低巨噬細(xì)胞的炎癥水平，抑制包括(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)在內(nèi)的多種炎癥因子的分泌[7]。巨噬細(xì)胞參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程，巨噬細(xì)胞遷移到斑塊后，通過(guò)分泌多種炎癥因子，引起斑塊負(fù)荷增大和纖維帽破裂，誘發(fā)不良心血管事件[8]。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)是巨噬細(xì)胞分泌的重要炎癥因子，可以激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化、成熟、增殖，誘導(dǎo)多種相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，加重AS斑塊的進(jìn)展[9-10]。同時(shí)，針對(duì)GMCSF的抗體通過(guò)調(diào)控髓系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞功能，可以降低MCP-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平，是心血管病免疫治療的潛在靶點(diǎn)[11-12]。因此，SGLT2抑制劑可能通過(guò)減少GM-CSF及其下游炎癥因子的分泌，減緩斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化。本研究選取鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞系作為研究對(duì)象，使用SGLT2抑制劑達(dá)格列凈分別進(jìn)行在體和離體干預(yù)，旨在觀察達(dá)格列凈對(duì)糖尿病AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響，并探究其機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性C57BL/6基因背景的ApoE-/-小鼠30只，SPF級(jí)，普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，第2周逐步替換為高脂高膽固醇飼料飼養(yǎng)，上述小鼠和飼料均購(gòu)于斯貝福北京生物?技術(shù)有限公司。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～24℃，濕度40%～60%，光暗間隔12 h，每籠3～4只，自由飲水。上述實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

2 實(shí)驗(yàn)材料 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))，RPMI-1640完全培養(yǎng)基(武漢普諾賽?生命科技有限公司)，PBS緩沖液[賽默飛?世爾科技(中國(guó))有限公司]，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO；Sigma-Aldrich?公司)，LPS(Sigma-Aldrich?公司)，CCK-8試劑盒 (日本同仁化學(xué)研究所)，小鼠GM-CSF、IL-6、TNF-α、MCP-1 ELISA試劑盒(北京成志科為?生物科技有限公司)，4%多聚甲醛固定液(武漢賽維爾?生物科技有限公司)，改良油紅O染色液(北京索萊寶?科技有限公司)，Anti-F4/80、Anti-Cleaved Caspase 3抗體[艾博抗(上海)?貿(mào)易有限公司]，生物素化山羊抗兔IgG(北京中杉金橋?生物技術(shù)有限公司)。

3 動(dòng)物分組及建模 上述30只小鼠分為動(dòng)脈粥樣硬化組(Con組，n=10)、動(dòng)脈粥樣硬化合并糖尿病胰島素干預(yù)組(Insulin組，n=10)和動(dòng)脈粥樣硬化合并糖尿病達(dá)格列凈干預(yù)組(Dapa組，n=10)。高脂高膽固醇飼料飼養(yǎng)8周后，禁食14 h，Insulin組和Dapa組小鼠腹腔注射STZ(Sigma-Aldrich公司)，劑量50 mg/kg，連續(xù)5 d[13]。注射結(jié)束1周后，尾靜脈采血測(cè)血糖，3次隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L視為糖尿病造模成功。糖尿病造模成功后，Insulin組小鼠腹腔注射甘精胰島素(0.75 U/mL，賽諾菲北京?制藥有限公司) 200 μL，Dapa組小鼠腹腔注射達(dá)格列凈(1 mmol/L，上海阿拉丁生化科技?股份有限公司) 200 μL，1次/d，連續(xù)8周，定期監(jiān)測(cè)體質(zhì)量，眼眶靜脈叢采血測(cè)血糖和血脂等。

4 小鼠血管取材及切片 連續(xù)干預(yù)8周后，經(jīng)異氟烷麻醉，全身灌注固定上述小鼠。具體操作：麻醉后，暴露小鼠心臟，剪開(kāi)小鼠右心耳，5 mL注射器針頭扎入左心室，緩慢推注PBS緩沖液。推注5～10 min觀察肝變白后，換4%多聚甲醛固定液繼續(xù)緩慢推注5～10 min。暴露位于脊柱左前側(cè)的完整主動(dòng)脈和心臟，眼科鑷輕輕剝離主動(dòng)脈周圍脂肪組織，小心剪去主動(dòng)脈走行過(guò)程中發(fā)出的分支，分離出上至頭臂干、左頸總動(dòng)脈、左鎖骨下動(dòng)脈，下至髂動(dòng)脈分叉的完整大體血管標(biāo)本和心臟，浸泡于4%多聚甲醛固定液。心臟經(jīng)沉糖48 h后，OCT包埋劑包埋，在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行主動(dòng)脈根部連續(xù)切片，切片厚度6 μm，每套收集30張切片。

5 病理染色 1)大體油紅O染色：將大體血管標(biāo)本置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，取出后PBS緩沖液浸洗2次，用彈簧剪小心地將血管縱向剖開(kāi)。將剖開(kāi)的血管浸入改良油紅O染液中，37℃浸染60 min，75%乙醇分化，使血管壁內(nèi)側(cè)脂肪斑塊呈橘紅色或鮮紅色，其余位置接近無(wú)色。蒸餾水洗滌2次后，將染好的大體血管標(biāo)本平展固定在黑色平板上拍照。使用Image J軟件定量分析油紅O染色陽(yáng)性動(dòng)脈粥樣硬化病變面積占血管總面積的百分比。2)切片油紅O染色和HE染色：將上述主動(dòng)脈根部切片按照傳統(tǒng)方法進(jìn)行染色后拍照。使用Photoshop勾勒出每張切片斑塊輪廓和管腔輪廓，使用Image J軟件定量分析每張切片中油紅O染色陽(yáng)性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比和HE染色斑塊面積占主動(dòng)脈管腔面積的百分比。3)免疫組化染色：將上述主動(dòng)脈根部冰凍切片室溫下平衡30 min后，丙酮固定10 min。PBS洗3次，每次5 min，3%過(guò)氧化氫孵育5 min。再用PBS洗3次后，每次5 min，室溫下山羊血清封閉10 min，接著滴加含F(xiàn)4/80抗體(稀釋200倍)的一抗工作液，濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。PBS洗3次，每次5 min，滴加生物素標(biāo)記二抗，37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，滴加DAB顯色劑顯色。自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，封片，顯微鏡下拍照。使用Image J軟件定量分析每張切片中斑塊內(nèi)F4/80陽(yáng)性區(qū)域面積占斑塊面積的百分比。

6 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)和達(dá)格列凈濃度預(yù)實(shí)驗(yàn) 凍存細(xì)胞復(fù)蘇后，配置RPMI 1640完全培養(yǎng)基并培養(yǎng)細(xì)胞[14]。培養(yǎng)環(huán)境：孵箱溫度37℃，5%CO2。每48 h換液1次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80% ～90%時(shí)進(jìn)行傳代，選擇復(fù)蘇后2～6代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行研究。使用DMSO溶解達(dá)格列凈，將含有達(dá)格列凈的DMSO溶解于培養(yǎng)基中。將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板，按照0.2%DMSO，0、1、5、10、50、100、500 mmol/L設(shè)置達(dá)格列凈干預(yù)濃度梯度，每個(gè)梯度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔中加入100 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，孵箱孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度(optical density，OD)。將0 mmol/L達(dá)格列凈對(duì)應(yīng)OD值為參考，設(shè)為100%，其余各組結(jié)果均以此為參考用百分比表示，選擇未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性的最大濃度行進(jìn)一步干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

7 達(dá)格列凈干預(yù)后RAW264.7細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè) 按照上述CCK-8接種方法，加入50 mmol/L達(dá)格列凈進(jìn)行干預(yù)，分別在0 h、24 h、48 h、72 h加入CCK-8試劑，孵育2 h后檢測(cè)450 nm處的OD值，觀察OD值隨時(shí)間變化情況。在六孔板中接種RAW264.7細(xì)胞，加入50 mmol/L達(dá)格列凈進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)72 h后提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)目的條帶Cleaved Caspase 3(CL Caspase3)和內(nèi)參β-actin，使用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。對(duì)照組加入與50 mmol/L達(dá)格列凈含相同濃度DMSO的培養(yǎng)基。每組重復(fù)3次。

8 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清炎癥因子 將RAW264.7細(xì)胞接種于24孔板，實(shí)驗(yàn)組使用達(dá)格列凈(50 mmol/L)預(yù)處理24 h后，加入LPS(100 nmol/L)誘導(dǎo)炎癥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后取24孔板中細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，按照ELISA試劑盒操作步驟，檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6、MCP-1、TNF-α、GM-CSF的濃度。炎癥對(duì)照組加入與50 mmol/L達(dá)格列凈含相同濃度DMSO的培養(yǎng)基預(yù)處理24 h，然后加入LPS(100 nmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。另設(shè)無(wú)上述處理的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)48 h作為空白對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn) 用 軟 件SPSS19.0進(jìn) 行 統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 達(dá)格列凈干預(yù)后小鼠基礎(chǔ)生理指標(biāo)變化 經(jīng)STZ處理后，Insulin組和Dapa組小鼠3次隨機(jī)血糖均較Con組升高，并超過(guò)16.7 mmol/L，提示糖尿病AS模型小鼠構(gòu)建成功(圖1)。模型構(gòu)建成功的小鼠按照分組進(jìn)行8周干預(yù)。Insulin組和Dapa組小鼠干預(yù)8周后隨機(jī)血糖較各組干預(yù)前均明顯降低(P＜ 0.05)，且兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。小鼠體質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，干預(yù)8周后，Insulin組和Dapa組體質(zhì)量均較Con組下降，Insulin組與Dapa組組間體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。干預(yù)8周后，各組間三酰甘油和總膽固醇差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 達(dá)格列凈干預(yù)后，小鼠血糖、體質(zhì)量、三酰甘油、總膽固醇指標(biāo)變化情況(aP＜0.05, vs Pre)Fig.1 Changes of blood glucose, body weight, triglyceride and total cholesterol in mice after dapagliflozin intervention (aP＜0.05, vs pre)

2 達(dá)格列凈干預(yù)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的影響 小鼠動(dòng)脈大體油紅O染色結(jié)果表明，Insulin組AS病變面積占血管總面積的百分比較Con組明顯升高，提示糖尿病會(huì)加速AS病變(圖2)。在糖尿病AS小鼠中，Dapa組AS病變面積占血管總面積的百分比較Insulin組明顯降低(P＜0.05)，證實(shí)了達(dá)格列凈延緩糖尿病AS病變進(jìn)展。

圖2 大體油紅O染色評(píng)估達(dá)格列凈干預(yù)后動(dòng)脈粥樣硬化病變Fig.2 Lesion of atherosclerosis after dapagliflozin intervention evaluated by gross oil red O staining

3 達(dá)格列凈干預(yù)后主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)和大小 主動(dòng)脈根部切片的油紅O染色(oil red O staining，ORO)和HE染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了達(dá)格列凈延緩糖尿病AS斑塊進(jìn)展(圖3)。ORO結(jié)果顯示，各組ORO陽(yáng)性區(qū)域面積占斑塊面積百分比均超過(guò)50%，證實(shí)了斑塊內(nèi)富含脂質(zhì)成分。HE染色結(jié)果顯示，Dapa組斑塊面積占管腔面積百分比較Insulin組明顯降低(P＜ 0.05)。

圖3 油紅O染色和HE染色評(píng)估達(dá)格列凈干預(yù)后主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊性質(zhì)及大小Fig.3 Characteristics and size of atherosclerotic plaque in aortic root after dagaglizin intervention evaluated by oil red O staining and HE staining

4 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞分布 主動(dòng)脈根部切片的免疫組化結(jié)果顯示(圖4)，F(xiàn)4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞主要分布于主動(dòng)脈根部AS斑塊肩部或者脂質(zhì)核心的上方，還有少量分布于斑塊內(nèi)部的壞死核心邊緣，這與既往研究結(jié)果一致。F4/80免疫組化染色結(jié)果局部放大，可以清楚顯示各組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，Insulin組巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量最多。定量分析進(jìn)一步表明，與Insulin組相比，Dapa組糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)面積明顯減少(P＜0.01)。

圖4 達(dá)格列凈干預(yù)后，不同組間動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況(aP＜0.01, vs Insulin)Fig.4 Macrophage infiltration in atherosclerotic plaques among groups after dapagliflozin intervention (aP＜0.01, vs insulin)

5 CCK-8篩選達(dá)格列凈干預(yù)最佳濃度 達(dá)格列凈干預(yù)24 h后，CCK-8結(jié)果顯示，隨著達(dá)格列凈濃度升高，RAW264.7細(xì)胞活性較空白組出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖5)。其中，濃度為100 μmol/L和500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著低于空白組(P＜ 0.01)，濃度為50 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性與空白組相比無(wú)顯著性變化，且各組中最大DMSO濃度(0.2% DMSO)組與空白組相比無(wú)顯著變化，排除了DMSO對(duì)活性的影響。因此50 μmol/L達(dá)格列凈是不影響細(xì)胞活性的最大濃度，可作為達(dá)格列凈干預(yù)的最佳濃度。

圖5 CCK-8檢測(cè)達(dá)格列凈干預(yù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響(aP＜0.01, vs 0 μmol/L)Fig.5 Effect of dapagliflozin intervention on RAW264.7 cell viability detected by CCK-8 (aP＜0.01, vs 0 μmol/L)

6 達(dá)格列凈對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖和凋亡的影響 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，達(dá)格列凈組(Dapa)和對(duì)照組(Con)的OD值均不斷增加(圖6)。達(dá)格列凈(50 μmol/L)干預(yù)72 h，可見(jiàn)Dapa組OD值較Con組出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)，證實(shí)了達(dá)格列凈對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的抑制作用。Western blot結(jié)果可見(jiàn)，凋亡相關(guān)蛋CL Caspase3條帶在Dapa組與Con組之間無(wú)顯著差異，進(jìn)一步的半定量分析也未見(jiàn)兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示達(dá)格列凈(50 μmol/L)未對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡產(chǎn)生顯著影響。

圖6 達(dá)格列凈對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.6 Effect of dapagliflozin on proliferation and apoptosis of RAW264.7 cells

7 達(dá)格列凈對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響 采用ELISA方法檢測(cè)干預(yù)后各組細(xì)胞上清液中炎癥因子分泌情況(圖7)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組(Con)相比，炎癥對(duì)照組(LPS)中炎癥因子IL-6、TNF-α、MCP-1、GM-CSF明顯升高，證實(shí)體外RAW264.7細(xì)胞炎癥模型誘導(dǎo)成功[15-16]。實(shí)驗(yàn)組(LPS + Dapa)經(jīng)達(dá)格列凈預(yù)處理后，與LPS組相比，IL-6、MCP-1顯著下降(P＜0.05)，TNF-α有下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)，與LPS組相比，LPS + Dapa 組GM-CSF也顯著降低(P＜0.01)，表明達(dá)格列凈通過(guò)體外直接作用抑制了GM-CSF等細(xì)胞炎癥因子的分泌。

圖7 ELISA檢測(cè)達(dá)格列凈對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌的影響(aP＜0.05, bP＜0.01, vs LPS)Fig.7 Effects of dapagliflozin on LPS-induced secretion of inflammatory cytokines in RAW264.7 cells detected by ELISA ( aP＜0.05, bP＜0.01,vs LPS)

討 論

近年來(lái)，EMPA-REG、CANVAS、DECLEAR等多個(gè)SGLT2抑制劑的大型臨床研究表明，SGLT2抑制劑在降低血糖的同時(shí)，可顯著降低糖尿病合并心血管疾病或心血管高危因素患者的心血管預(yù)后[3,17-18]。DECLEAR研究進(jìn)一步揭示了SGLT2抑制劑在降低致命和非致命AS相關(guān)事件風(fēng)險(xiǎn)中的重要作用[3,19]。SGLT2抑制劑改善糖尿病患者AS的作用方式，除了直接控制血糖外，還包括減輕容量負(fù)荷、保護(hù)腎、減少炎癥等方面[7]，但其具體機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)SGLT2抑制劑抑制巨噬細(xì)胞增殖和GM-CSF相關(guān)炎癥因子分泌可能是改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。

在小鼠動(dòng)物模型中，達(dá)格列凈、恩格列凈、卡格列凈等被證明可以減輕糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化病變[20-22]。Leng等[20]的研究顯示，與對(duì)照組相比，達(dá)格列凈可使糖尿病ApoE-/-小鼠胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈粥樣硬化病變面積減少34%，主動(dòng)脈根部病變面積減少64%。本研究中，達(dá)格列凈干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈糖尿病AS病變面積百分比與胰島素組相比減少了38%，主動(dòng)脈根部病變面積百分比與胰島素組相比減少了25%，與上述研究結(jié)論一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，合并糖尿病的AS小鼠斑塊內(nèi)大量巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，達(dá)格列凈劑干預(yù)8周后，斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較胰島素組明顯減少，這與Ganbaatar等[23]使用恩格列凈干預(yù)結(jié)果類似。同時(shí)，本研究使用胰島素干預(yù)作為陽(yáng)性對(duì)照，保證了達(dá)格列凈和胰島素兩組血糖、體質(zhì)量、血脂等指標(biāo)的一致性，排除了上述因素對(duì)結(jié)果的干擾，使結(jié)論更為可靠。

多項(xiàng)研究表明，GM-CSF作為促炎細(xì)胞因子，可以加重多種慢性自身免疫和炎癥性疾病，包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化和動(dòng)脈粥樣硬化[9-10]。GM-CSF可以有效刺激粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞系的增殖、分化和成熟[10-11]，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在斑塊內(nèi)的浸潤(rùn)[10-11,24]。小鼠靜脈注射GM-CSF可顯著促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化病變細(xì)胞增殖，而抗GM-CSF抗體功能阻斷GM-CSF則可抑制細(xì)胞增殖[24]。GM-CSF可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多TNF-α、IL-6等炎癥因子，并通過(guò)離體作用促進(jìn)促炎M1巨噬細(xì)胞形成，與體內(nèi)巨噬細(xì)胞M1極化有關(guān)[25]。本研究使用LPS處理小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥模型，GM-CSF分泌水平顯著升高。達(dá)格列凈預(yù)處理后，GM-CSF及IL-6和MCP-1水平顯著下降，證明了SGLT2抑制劑可以通過(guò)直接作用減輕巨噬細(xì)胞炎癥，并且可以減少GM-CSF及其下游炎癥因子的分泌。上述途徑可能是達(dá)格列凈減少斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的原因之一。另外，本研究顯示達(dá)格列凈可以抑制巨噬細(xì)胞增殖，可能也與達(dá)格列凈抑制GM-CSF分泌，進(jìn)而減弱細(xì)胞增殖能力有關(guān)。Ying等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB增加GM-CSF旁分泌，使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定。Yang等[26]的研究也證實(shí)了NF-κB在調(diào)控GM-CSF分泌中的作用。部分離體實(shí)驗(yàn)表明，達(dá)格列凈可以降低LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)，抑制高糖誘導(dǎo)的NF-κB的激活，從而抑制炎癥改變[27-28]。因此，NF-κB可能是達(dá)格列凈降低巨噬細(xì)胞分泌GM-CSF的途徑之一，這有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。同時(shí)，相關(guān)研究表明另一種SGLT2抑制劑卡格列凈可抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖，該抑制作用發(fā)生在沒(méi)有細(xì)胞死亡的情況下，并與細(xì)胞周期阻滯和DNA合成減少有關(guān)[29]。結(jié)合本研究的凋亡檢測(cè)結(jié)果，50 μmol/L達(dá)格列凈抑制巨噬細(xì)胞增殖的同時(shí)未對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，達(dá)格列凈抑制巨噬細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)，而非誘導(dǎo)凋亡，這有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上，本研究證實(shí)SGLT2抑制劑達(dá)格列凈可以抑制巨噬細(xì)胞的增殖和GM-CSF及相關(guān)下游炎癥因子的分泌。這可能是達(dá)格列凈減少糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、改善糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制之一。