FBXO40對(duì)心肌細(xì)胞增殖的作用

謝敬儀,王琪,王濤,錢麗麗

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院,山東 青島 266021)

嚴(yán)格的蛋白質(zhì)控制在心臟的發(fā)育與功能維持方面發(fā)揮重要作用，蛋白質(zhì)代謝或運(yùn)輸異常存在于多種心臟疾病中。泛素蛋白酶體系統(tǒng)在調(diào)控錯(cuò)誤折疊蛋白或損傷蛋白降解方面發(fā)揮重要作用，其中，E3泛素連接酶尤為重要，它通過對(duì)細(xì)胞關(guān)鍵蛋白的識(shí)別、相互作用和泛素化，在細(xì)胞增殖和分化等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)，泛素連接酶參與細(xì)胞增殖的調(diào)控，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子(其中許多具有腫瘤抑制或致癌功能)的破壞與癌癥的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)；癌抑制蛋白的非正?；蚩焖俳到?，或者是癌蛋白的大量堆積，都會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化。2006年，NAKAYAMA等[2]發(fā)現(xiàn)，Skp1-Cul1-F-box(SCF) E3泛素連接酶復(fù)合體的特異性泛素化導(dǎo)致細(xì)胞增殖、基因組不穩(wěn)定甚至是癌癥。2016年，LIU等[3]研究表明，泛素蛋白酶FAT10可調(diào)控癌細(xì)胞的增殖。2020年，GUO等[4]研究表明，泛素蛋白酶HRD1在谷氨酰胺缺乏的條件下可特異性抑制三陰性乳癌細(xì)胞增殖。

F-box蛋白是E3泛素連接酶的一種，F(xiàn)BXO40是2007年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白，其在骨骼肌和心肌中特異性高表達(dá)，而且在去神經(jīng)性肌肉萎縮樣本中的表達(dá)也顯著上調(diào)[5]。2011年SHI等[6]研究結(jié)果表明，SCF-FBXO40復(fù)合體在骨骼肌中通過誘導(dǎo)胰島素受體底物1(IRS1)蛋白降解來抑制胰島素樣生長因子1(IGF1)誘導(dǎo)的骨骼肌肥大信號(hào)通路。然而，F(xiàn)BXO40在心肌中的研究尚未見報(bào)道。本研究旨在探討FBXO40對(duì)心肌細(xì)胞增殖是否具有調(diào)控作用以及發(fā)揮怎樣的作用，以期為心肌疾病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM-F12培養(yǎng)液、PBS緩沖液(美倫生物公司)，胎牛血清(BI公司)，Trizol總RNA提取試劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green預(yù)混型實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)試劑盒(艾瑞克生物公司)，胰液素(美國Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司)，DEPC原液、qPCR引物(擎科生物公司)，siRNA序列及NC對(duì)照序列(上海吉瑪生物科技有限公司)，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)，CCK-8試劑盒(同仁化學(xué)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 解剖大鼠乳鼠取出心臟，在PBS緩沖液中洗滌至無血污；將心臟剪碎后置于含有胰液素和膠原酶的消化工作液中(用PBS液加到50 mL)，在37 ℃恒溫水浴鍋中消化6～8 min，收集每次消化后的上清液，剩余組織加入5 mL消化液繼續(xù)消化，直至組織塊被完全消化；將上清液收集到離心管中以800～1 000 r/min離心5～6 min，棄上清，將沉淀的細(xì)胞加入DMEM-F12培養(yǎng)液(加青霉素/鏈霉素雙抗)中吹打混勻清洗后，再次離心去上清，將剩余沉淀再次懸浮于DMEM-F12培養(yǎng)液(加青霉素/鏈霉素雙抗)中，經(jīng)260目過濾網(wǎng)過濾到培養(yǎng)皿，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1.5～2.0 h，最后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。整個(gè)過程在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行無菌操作。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)原代心肌細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、敲低組和過表達(dá)組。對(duì)照組細(xì)胞不做處理。敲低組先將溶解的3.5 μL si-FBXO40小干擾RNA加入到125 μL無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻(標(biāo)為1號(hào)管)，過表達(dá)組則先將2.5 μL的FBXO40過表達(dá)載體加入到125 μL無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻(2號(hào)管)，置室溫3～5 min；將7 μL Lipofectamin 3000加入250 μL無血清DMEM-F12培養(yǎng)液中混勻(3號(hào)管)，室溫放置3～5 min；將3號(hào)管中試劑按1∶1的比例分入1號(hào)、2號(hào)管中混勻，室溫下靜置20～25 min；敲低組和過表達(dá)組分別將1號(hào)、2號(hào)管中液體加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3qPCR檢測(cè)增殖相關(guān)基因的表達(dá) 用Trizol試劑提取原代心肌細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA濃度及純度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和qPCR。模板cDNA使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建，qPCR體系根據(jù)試劑盒說明書設(shè)置。引物序列見表1。將qPCR的定量結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算Cdc20、Ccna2、Cyr61和Aurkb基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將原代心肌細(xì)胞懸液接種于96孔板中(每孔約1×104個(gè)細(xì)胞)，分為對(duì)照組、敲低組和過表達(dá)組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，各組細(xì)胞的處理同1.2.2。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次[7]。

表1 qPCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)FBXO40后心肌細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)變化

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，過表達(dá)組細(xì)胞成功誘導(dǎo)FBXO40過表達(dá)(t=45.22，P<0.01)；與對(duì)照組相比較，過表達(dá)組原代心肌細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ccna2、Cdc20、Aurkb和Cyr61的表達(dá)均明顯上調(diào)(t=2.20～3.90，P<0.05)。見表2。

表2 兩組心肌細(xì)胞中增殖相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的比較

2.2 敲低FBXO40后心肌細(xì)胞中Cyr61基因的表達(dá)變化

qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低組的原代心肌細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染si-FBXO40小干擾RNA(t=8.27，P<0.05)；與對(duì)照組相比，敲低組原代心肌細(xì)胞中促增殖基因Cyr61的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.96，P<0.05)。見表3。

表3 兩組心肌細(xì)胞Cyr61基因相對(duì)表達(dá)量的比較

2.3 FBXO40對(duì)心肌細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染24 h后CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、過表達(dá)組和敲低組的吸光度值分別為0.191±0.005、0.205±0.002和0.154±0.030(n=3)，過表達(dá)組的吸光度值高于對(duì)照組，敲低組的吸光度值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.72，P<0.05)。表明敲低FBXO40會(huì)抑制原代心肌細(xì)胞增殖，而過表達(dá)FBXO40能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

3 討 論

泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與多種細(xì)胞過程的調(diào)控，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、轉(zhuǎn)錄和凋亡等[8-11]。在細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞的有絲分裂周期是一個(gè)被嚴(yán)格調(diào)控的過程，有絲分裂的進(jìn)程復(fù)雜，需要通過泛素連接酶的復(fù)雜催化和蛋白酶復(fù)合體對(duì)底物的降解來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[12]。細(xì)胞周期調(diào)控過程主要是周期蛋白依賴性激酶(CDKs)的連續(xù)性激活，通過CDKs以及周期蛋白激酶抑制劑(CKIs)的泛素介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的水解。在真核細(xì)胞中，E3泛素連接酶的兩個(gè)家族，即后期促進(jìn)復(fù)合物和SCF蛋白復(fù)合體，負(fù)責(zé)許多CDKs調(diào)節(jié)因子的泛素化和蛋白酶體降解，確保細(xì)胞周期的精確調(diào)控[13-14]。在過去的幾十年里，越來越多的證據(jù)表明，由于蛋白水解控制不力而導(dǎo)致的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變異常，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，最終影響身體功能甚至是發(fā)生癌變[15-17]。一些泛素化因子通過調(diào)控細(xì)胞增殖以及細(xì)胞周期進(jìn)程來參與心血管疾病的治療[18]。因此，更好地理解細(xì)胞增殖，了解細(xì)胞周期調(diào)控中泛素信號(hào)的多樣性和復(fù)雜性，將為精確控制細(xì)胞周期進(jìn)程和解決癌癥或心血管疾病的臨床治療問題提供新的思路。

E3泛素連接酶在蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)-box蛋白作為一種E3泛素連接酶是SCF的重要組成部分，它通過F-box結(jié)構(gòu)域與Skp1相互作用，并通過其他相互作用區(qū)域與蛋白結(jié)合并使其泛素化進(jìn)而介導(dǎo)蛋白水解[19]。F-box蛋白根據(jù)其特異性底物識(shí)別域可分為3個(gè)亞類：FBXW亞類含有WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域，由10個(gè)成員組成；FBXL亞類富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，有22個(gè)家族成員；其余37種F-box蛋白被指定為FBXO蛋白，其中包含各種尚未被完全鑒定的結(jié)構(gòu)域[20-23]。FBXO40蛋白是2007年發(fā)現(xiàn)的一種F-box蛋白。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BXO40在骨骼肌和心肌中特異性高表達(dá)[5]，然而FBXO40在心肌中的作用未見報(bào)道。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，初步探究了FBXO40在心肌細(xì)胞增殖過程中是否具有調(diào)控作用，以及具有怎樣的調(diào)控作用。本研究首先采用qPCR方法檢測(cè)過表達(dá)FBXO40后原代心肌細(xì)胞中增殖相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，在原代心肌細(xì)胞中過表達(dá)FBXO40后，與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因Ccna2、Cdc20、Aurkb、Cyr61的表達(dá)均顯著上調(diào)，提示FBXO40具有促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的作用。隨后，本研究又通過敲低原代心肌細(xì)胞中的FBXO40表達(dá)，分別采用qPCR和CCK-8方法檢測(cè)了具有促增殖作用的基因Cyr61相對(duì)表達(dá)量的變化以及細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與過表達(dá)FBXO40相反，敲低FBXO40表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了FBXO40對(duì)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用。在后續(xù)工作中我們將進(jìn)一步探究FBXO40在心肌細(xì)胞增殖中的具體調(diào)控通路，為心血管疾病的預(yù)防治療提供新的靶標(biāo)。