泛素鏈的體外制備、磷酸化修飾與標記方法

覃凌云 聶澤鋒 唐 淳

（1）中國科學(xué)院精密測量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院，武漢 430071；2）北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871；3）中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

泛素（ubiquitin，Ub）是細胞中一類重要的信號蛋白。泛素的“泛”指的是它在細胞中普遍存在，并廣泛參與調(diào)節(jié)細胞的生理功能。泛素蛋白行使功能主要過程包括：a.寫入（writing），在泛素連接酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3的順序作用下，對蛋白質(zhì)等底物（substrate）進行泛素化修飾；b.讀?。╮eading），泛素本身與不同的靶蛋白相互結(jié)合，募集上下游的蛋白質(zhì)，啟動相應(yīng)的信號通路；c.擦除（erasing），被去泛素化酶（deubiquintase，DUB）去泛素化，終止其作用［1-4］。目前已知能夠與泛素蛋白結(jié)合的靶蛋白（target protein）有上千種，它們的結(jié)構(gòu)和功能各異，泛素與靶蛋白的結(jié)合通過構(gòu)像選擇機制進行，而泛素之所以能夠?qū)崿F(xiàn)與眾多靶蛋白的結(jié)合，主要原因是泛素單體存在動態(tài)結(jié)構(gòu)，泛素鏈的亞基間存在豐富的動態(tài)結(jié)構(gòu)［5-10］。

泛素的結(jié)構(gòu)決定它的功能，而決定其結(jié)構(gòu)的有以下幾個原因。首先，泛素之間可以通過共價連接形成二聚泛素以及更長的多聚泛素鏈。一個泛素蛋白有7個賴氨酸（分別是K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63），加上氮端的氨基，共有8種方式可以和另一個泛素蛋白的碳端羧基形成異肽鍵。這些鏈接方式，可以同種連接形成不同長度的泛素鏈。然而，泛素間也可以不同連接的方式形成分枝狀的連接，形成各種不同的組合方式，這些連接方式的亞基較少。不同連接方式的多聚泛素鏈，其亞基之間的四級結(jié)構(gòu)不同，使它們能夠與不同的靶蛋白結(jié)合，參與調(diào)控不同的細胞功能。如K48連接的泛素鏈能夠與蛋白酶體的泛素受體結(jié)合，參與蛋白質(zhì)降解［11-12］。其次，泛素單體之間的極弱相互作用，使泛素鏈中兩個相鄰亞基之間形成動態(tài)的四級結(jié)構(gòu)。泛素單體之間的非共價相互作用（KD≈5 mmol/L）［8］，以共價連接形成的泛素鏈中兩個相鄰亞基能夠達到這個有效濃度。這樣的相互作用，使亞基之間能夠處于不同的構(gòu)象。如K63連接的二聚泛素（K63-diUb），可以有打開（open）、閉合（close）、部分打開（partially open）3種互變的構(gòu)象［7］，它們分別結(jié)合不同的靶蛋白，介導(dǎo)不同的功能，K63-diUb的不同構(gòu)象，能夠分別與激活和抑制NF-κB信號通路的靶蛋白結(jié)合?？傊捎诠矁r連接方式的不同、各亞基之間非共價相互作用的存在，使得泛素鏈的四級結(jié)構(gòu)多樣復(fù)雜。泛素鏈通過構(gòu)象選擇性機制，在與特定的靶蛋白相結(jié)合時，使得某一種構(gòu)象得以穩(wěn)定。通過誘導(dǎo)契合機制，使結(jié)合更加緊密。最后，啟動相應(yīng)的信號通路。

泛素除了能夠靶向底物從而實現(xiàn)不同的生理功能，自身也能夠被修飾，比如乙酰化、磷酸化、ADP-核糖基化、磷酸核糖化、脫酰胺作用、SUMO修飾和琥珀?；?。以上這些定點修飾進一步增加了泛素網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性［2］。本文結(jié)合實驗室研究較為成熟的磷酸化修飾為例來說明磷酸化對泛素網(wǎng)絡(luò)的影響［9］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)泛素鏈的四級結(jié)構(gòu)可以受到泛素磷酸化的調(diào)節(jié)，從而有可能改變泛素的信號系統(tǒng)。泛素蛋白的Ser65能夠被PINK1（PTEN-inducing kinase 1）磷酸化，磷酸化誘導(dǎo)泛素蛋白在生理溫度下出現(xiàn)兩種不同的結(jié)構(gòu)，分別稱為收縮態(tài)（retracted state）和舒張態(tài)（relaxed state）［13-15］。這兩個態(tài)的出現(xiàn)，使泛素鏈的結(jié)構(gòu)也發(fā)生更為復(fù)雜的變化。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，大部分E1、E2泛素酶利用磷酸化泛素時，泛素化底物和生成泛素鏈的活性降低，而少部分E1、E2泛素酶的活性增強［16-17］，也就是說泛素單體一旦被泛素化后，可以影響寫碼器（writer）的活性。PINK1能夠磷酸化泛素鏈中的任意亞基，以及結(jié)合在底物上的泛素，這些泛素一旦被磷酸化后，能夠影響去泛素化酶的活性，大部分的去泛素化酶活性下降，而個別增加［17-21］，也就是說可以影響擦除器（eraser）的活性。從細胞水平上來看，包括癌癥、衰老和神經(jīng)退行性疾病等，PINK1和pUb的水平都顯著增加［22-24］。然而到目前為止，PINK1和pUb扮演的生理功能角色還遠未確定［25］。因此這些定點修飾的樣品制備也成為了泛素自身修飾研究最基礎(chǔ)的步驟。

泛素鏈的樣品制備對泛素的結(jié)構(gòu)和功能研究具有決定作用。目前對于泛素鏈的制備主要分為生物酶法制備和化學(xué)合成兩種方式。生物酶法制備指的是以下制備途徑。首先，在E1的作用下形成E1-泛素硫酯中間體。接下來泛素被轉(zhuǎn)移至E2上形成E2-泛素硫酯中間體，通常這一步驟的中間體能夠特異性識別泛素的Lys側(cè)鏈氨基或者M1氨基。但是對于部分鏈類型，E2-泛素硫酯中間體仍會在E3的幫助下特異性識別泛素的待鏈接位點。通過以上的E1-E2-E3級聯(lián)反應(yīng)，完成不同泛素鏈的鏈接過程。如果上述的級聯(lián)過程特異性不專一，還可以通過去泛素化酶DUB特異性降解上述非特異性的鏈接方式?；瘜W(xué)合成指的是采用蛋白多肽固態(tài)合成的方式，將泛素分成不同的幾段，然后定點引入到待修飾的Lys側(cè)鏈，從而實現(xiàn)制備不同鏈接方式的多聚泛素。清華大學(xué)劉磊等［26-27］采用化學(xué)合成的方式，已經(jīng)在K27、K48和K63多聚泛素制備方面做了大量工作。接下來，本論文將主要討論采用生物酶來制備各種形式的泛素樣品，其中由于K27的特異性E2和E3酶缺失，將不予討論。

1 材料與方法

1.1 E1、E2、E3及DUB酶的純化

泛素鏈制備涉及到的各種E1、E2、E3及DUB酶所對應(yīng)的泛素鏈類別見表1。各種酶的氨基酸圖式見圖1。E1酶［28-29］可用于所有的泛素鏈的合成。K6、K29、K33 3種連接方式的E2共用一種酶UBE2L3［30］，但是其E3酶各不相同，分別是NIeL［31-32］、UBE3C［33］和AREL1［34］。K11的E2為UBE2S-UBD［35］，Cezanne能夠特異性降解K11泛素鏈［35］。K48的E2為E2-25K［36］，OTUB1能夠特異性降解K48泛素鏈［37］。K63的E2為ScUbc13和ScMMS2兩種酵母E2的融合蛋白［38］，AMSH能夠特異性降解K63泛素鏈［34］。M1的E2為UBcH5c［39］，E3為HOIP-RBR-C［40］。以上各種酶所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21宿主中，挑單克隆菌落，由1 ml至1 L進行逐級擴大培養(yǎng)。當A600達到0.6～1.0時，加入IPTG終濃度為0.2 mmol/L，低溫（18℃）誘導(dǎo)過夜。為了盡量減少純化過程對酶活的影響，全程的純化過程需要低溫條件下進行。由于上述酶都帶有His或者GST親和標簽，因此上述酶的純化可以分為兩類進行。His標簽的緩沖液體系為：緩沖液A（20 mmol/L tris、pH 8.0，300 mmol/L NaCl，10%甘油），緩沖液B（緩沖液A+1 mol/L咪唑）。GST標簽的緩沖液體系為：緩沖液A（20 mmol/L磷酸鹽、pH 7.3，300 mmol/L NaCl，10%甘油），緩沖液B（20 mmol/L tris、pH 8.0，10%甘油）。樣品經(jīng)親和柱純化后，需要過排阻色譜進行進一步純化，緩沖液體系為20 mmol/L tris、pH 8.0，150 mmol/L NaCl，10%甘油。一般來說，經(jīng)過親和純化和排阻色譜純化后，酶的純度已經(jīng)能夠滿足泛素多聚體的鏈接。

Table 1 E1,E2,E3 and DUB are involved in the synthesis of different ubiquitin chains

Fig.1 Schematic diagram of the amino acid structure of E2,E3 and DUB(UniProt ID and the corresponding amino acid number are shown in the brackets)

Table 2 The construction strategy of the distal and proximal subunits of different di-ubiquitin

1.2 非DUB參與的泛素鏈制備

多聚泛素制備采用的是體外生物酶法反應(yīng)來制備多聚泛素。在生物酶法制備泛素鏈中，又分成了兩種制備方式。一種是不采用DUB來制備泛素鏈，由于K6、K11、K29、K33在酶法反應(yīng)過程中會生成其他非特異形式的泛素鏈，因此將近端亞基端的賴氨酸突變成精氨酸以封閉非特異性的連接方式，對遠端亞基端也進行封閉（但是不能封閉需要連接的Lys位點）。另外，遠端亞基的C端還需加入一個天冬氨酸（D77）將G76進行封閉。各種泛素鏈所需的近端亞基和遠端亞基的Lys突變方案見表2。以K48泛素鏈為例，反應(yīng)體系設(shè)置為：0.5 mmol/L Ub-K48R、0.5 mmol/L Ub-77D、250 nmol/L E1、5μmol/L E2、40 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L ATP、10 mmol/L PBDM（磷酸肌酸）、0.002 U磷酸肌酸激酶、0.5 mmol/L Ppase（無機焦磷酸化酶）、10 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT，pH8.0，在25℃條件下反應(yīng)6 h左右（其他的鏈接方式的反應(yīng)體系以K48為參考）。二聚泛素鏈接成功后，如果需要再延長泛素鏈，再用YUH1酶［41］對遠端的D77水解，然后以二聚泛素作為近端，以帶有D77的泛素單體作為遠端亞基再作酶反應(yīng)。以此類推，可以得到滿足實驗要求的不同鏈長樣品。最后用陽離子親和柱（Source-S柱，GE Healthcare）對反應(yīng)產(chǎn)物進行分離。

1.3 DUB參與的泛素鏈制備

另一種生物酶法制備方式是采用DUB來降解生成的非特異性鏈接泛素鏈。因此，此種方法的泛素材料可以直接使用野生型泛素。在E1、E2、E3反應(yīng)以后，會得到不同聚合程度的泛素鏈。如果反應(yīng)時間越長，得到的聚合程度會越高。因此，可以根據(jù)實驗預(yù)期的泛素聚合程度，大致確定反應(yīng)時間。以二聚泛素為例，對于M1、K48和K63來說，由于沒有非特異性的泛素鏈產(chǎn)生，因此可以直接用陽離子親和柱（Source-S柱）對反應(yīng)產(chǎn)物進行分離。對于K6、K11、K29、K33來說，由于存在或多或少的非特異性鏈接，因此需要用對應(yīng)的DUB酶作進一步的處理。DUB酶的反應(yīng)量一般以Ub∶DUB=200∶1加入，反應(yīng)溫度為25℃或者37℃，過夜反應(yīng)。

1.4 磷酸化泛素的制備

PINK1來源于體虱（phPINK1），其制備方法在之前已有描述［13］。對于野生型泛素的磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)體系中泛素、phPINK1和ATP的摩爾濃度比為1∶0.01∶50。反應(yīng)的緩沖液體系為：20 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，pH 7.4。反應(yīng)溫度設(shè)置為25℃，過夜反應(yīng)。最后用陽離子親和柱（Source-Q柱）對反應(yīng)產(chǎn)物進行分離。用質(zhì)譜（Agilent G6530QTOF）進行鑒定。當需要對泛素鏈中部分亞基進行磷酸化修飾時，有兩種方案可供選擇。一是先對待修飾的亞基進行磷酸化修飾，然后再按照1.2的方法進行泛素鏈的制備，此過程需要注意的是磷酸化以后的泛素可能會降低泛素鏈的酶活反應(yīng)；第二種方案是將不進行磷酸化修飾的亞基S65位進行突變，先按照1.2的方法制備泛素鏈，然后再進行磷酸化反應(yīng)。具體的實施方案根據(jù)實驗的具體情況而定。

1.5 分支型泛素鏈的制備

上述討論的都是同型多聚泛素，但細胞內(nèi)也同樣普遍存在著異型多聚泛素。異型多聚泛素也分為混合型和支鏈型。以三聚泛素為例說明，Ub1、Ub2、Ub3代表三聚泛素的3個亞基?；旌闲头核劓溨傅氖荱b1通過其G76與Ub2的8個可能位點形成二聚，然后Ub2的G76與Ub3的剩余7個位點（除去Ub1/Ub2已經(jīng)形成的聚合類型）繼續(xù)延長泛素鏈，理論上混合型泛素鏈有56種形式。分支型泛素鏈指的是Ub1和Ub2都通過其G76與Ub3的8個可能位點中的兩個位點形成共價連接，形成分支狀，理論上分支型泛素鏈有28種形式［42］。目前異型泛素鏈的結(jié)構(gòu)特征及功能研究已經(jīng)被報道，已鑒定的異型泛素鏈包括K11/K48、M1/K63、K29/K48、K11/K63和K48/K63泛素鏈［32，43-44］。其中K11/K48分支型泛素鏈已經(jīng)被證實能夠促進其修飾的底物被蛋白酶體識別降解［45］。本文以本課題組正在研究的K11/K48分支泛素鏈為例，闡述其制備路線。其制備路線可以采用兩種：一是首先制備K48二聚泛素，然后以K48二聚泛素為基礎(chǔ)，通過合成K11二聚泛素的方法合成K11/K48分支泛素鏈；二是首先制備K11二聚泛素，然后再引入K48鏈接。上述各個步驟的反應(yīng)條件與二聚泛素的反應(yīng)條件一致，具體反應(yīng)體系不再贅述。

2 結(jié) 果

2.1 非DUB參與的泛素鏈制備結(jié)果

在二聚泛素的鏈接過程中，為了控制鏈長，在近端亞基端引入D77。為了避免形成非特異性鏈接，將引起非特異性鏈接的Lys突變成Arg。以K63的多聚泛素制備為例，K63-diUb及K63-triUb的蛋白質(zhì)膠圖及質(zhì)譜圖見圖2。這種策略可以精準控制多聚泛素的形成，從而實現(xiàn)對不同亞基的結(jié)構(gòu)和功能研究。比如在研究二聚泛素磷酸化的過程中，需要表征不同亞基的磷酸化特征以及磷酸化以后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，可以選擇先對待研究亞基進行磷酸化，然后再進行二聚反應(yīng)。對于反應(yīng)過程中特異性較差的K29和K33而言，進一步發(fā)現(xiàn)其特異性的E3酶對泛素的精準制備顯得尤為重要。同時有文獻表明［46］，將泛素的7個Lys全部突變成Arg后（簡稱為K0-Ub），K0-Ub的1H-15N-HSQC譜圖相較于野生型泛素而言發(fā)生了一定程度的化學(xué)位移擾動，對K0-Ub的溶液結(jié)構(gòu)解析發(fā)現(xiàn)，其骨架結(jié)構(gòu)與野生型泛素仍然保持一致。因此認為Lys突變?yōu)锳rg并不會引起泛素結(jié)構(gòu)的變化。

2.2 DUB參與的泛素鏈制備結(jié)果

為了減少Arg突變對泛素體系的影響，可以選擇使用DUB的方式來制備泛素鏈。這種方式制備的泛素鏈能夠更加真實地模擬細胞內(nèi)形成的泛素體系。M1、K6、K11、K29、K33、K48和K63的反應(yīng)體系結(jié)果見圖3a。如果E2/E3的特異性高，可以在反應(yīng)完成后不加DUB處理，比如M1、K48和K63的鏈接形式。以M1的多聚反應(yīng)為例，如果需要進一步的分離，需要過Source-S柱進行進一步純化（圖3b，c）。圖3b中顯示的純化柱為手動制作，能夠填裝更多填料，且柱子呈細長，因此具有較好的分離效果。Source-S柱經(jīng)過改良，保證了不同鏈長的分離效果，且在陽離子柱洗脫過程中，應(yīng)將洗脫梯度盡可能的降低。取M1-diUb的純化譜峰用作質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果顯示M1-diUb的表觀分子質(zhì)量與理論分子質(zhì)量完全一致（圖3d）。用此種方法制備的泛素鏈低聚產(chǎn)物會占較大比例，如果需要制備更高聚的產(chǎn)物，可以將反應(yīng)的基礎(chǔ)單元monoUb替換為diUb甚至是triUb。另外，可以適當延長反應(yīng)時間以及增加酶量。以K48泛素鏈為例，反應(yīng)體系原設(shè)置為：0.5 mmol/L Ub、250 nmol/L E1、5μmol/L E2-25K，反應(yīng)條件為25℃，6 h。調(diào)整后可設(shè)置為：0.5 mmol/L Ub、500 nmol/L E1、10μmol/L E2-25K，反應(yīng)條件為25℃，12 h。為了盡可能防止副產(chǎn)物的產(chǎn)生，反應(yīng)體系應(yīng)保持新鮮，即在適當?shù)姆磻?yīng)時間后，可以繼續(xù)添加酶量，也可以將反應(yīng)體系作粗純化后得到只含有泛素的產(chǎn)物，然后再繼續(xù)加入其他材料進行反應(yīng)。

Fig.2 Mass spectra of di-and tri-K63 polyUb

2.3 磷酸化泛素制備結(jié)果

野生型泛素在PINK1激酶的作用下，能夠高效地生成磷酸化泛素。對野生型泛素和磷酸化泛素分別進行質(zhì)譜和phos-Tag蛋白膠的鑒定（圖4a，b）。質(zhì)譜結(jié)果顯示，磷酸化泛素的相對分子質(zhì)量正好增加了79 u，符合磷酸根的相對分子質(zhì)量。Phos-Tag蛋白膠結(jié)果顯示，pUb的條帶明顯高于野生型泛素，說明pUb的磷酸根與膠中的Mn2+結(jié)合，減緩了pUb的遷移速率。此外，也用核磁1H-15N-HSQC譜圖表征了野生型泛素的磷酸化速率。同樣，通過S65A突變的方式，對M1、K48、K63diUb的遠端亞基和近端亞基的磷酸化速率進行了表征。通過一系列的磷酸化實驗，能夠證實不同泛素鏈的不同亞基都能夠被磷酸化。但是在真實的細胞環(huán)境中，不同亞基的磷酸化速率如何，或者說不同亞基的磷酸化順序如何，還需要做系統(tǒng)的研究。

Fig.3 Deubiquitinating enzymes participate in the preparation of different types of polyubiquitin chains

2.4 分支型泛素鏈的制備結(jié)果

K11/K48分支泛素鏈制備，首先需要制備K48二聚泛素。按照上述泛素突變體的制備策略，將遠端亞基的K48突變?yōu)镽，防止被其他泛素在連接在48位點，在近端亞基的C端加上氨基酸D77，這是為了只使遠端亞基提供游離的C端，從而控制只形成二聚泛素。之后，以Ub-K11R-K48R突變體為K11/K48分支型泛素鏈的最后一個亞基。Ub-K11R-K48R突變體的目的是為了在反應(yīng)過程中生成K11-diUb和K48-diUb。然后以表1中K11的連接體系為參考，即可生成K11/K48分支型泛素鏈。但是由于UBE2S-UBD的非特異性作用，除了能夠在K11位點反應(yīng)，也能夠在K63位點反應(yīng)，因此會生成10%的K63連接泛素鏈。為了除去形成的K63鏈接泛素鏈，在最終的反應(yīng)體系中加入DUB酶AMSH。當然，K11/K48分支泛素鏈制備也可以首先制備K11二聚泛素，之后的制備順序同上。兩種方式的制備效率相近。圖4d為K11/K48分支泛素鏈的示意圖。將制備好的K11/48-triUb樣品通過OTUB1酶分別處理0、5、15、30、60、90 min。SDS-PAGE鑒定見圖4c，可以證實K11/48-triUb樣品也能夠驗證OTUB1的酶活效率。

Fig.4 Identification of phosphorylated ubiquitin and branched ubiquitin

3 討 論

泛素系統(tǒng)中涉及到的E1、E2、E3及DUB酶的研究對泛素樣品的制備至關(guān)重要。由于目前對不同泛素組合鏈所需的E2、E3及DUB酶的研究認識仍然有限，因此對不同泛素組合鏈結(jié)構(gòu)和功能也不全面。特別是缺乏對細胞中針對E3連接酶特異性的泛素化事件的直接鑒定方法［2］。目前關(guān)于K48和K63的泛素鏈研究已經(jīng)非常深入，但是對于一些非典型的泛素鏈的研究仍然有待拓展。Xu等［47］通過質(zhì)譜定量分析對酵母細胞中7種Lys鏈接的泛素鏈比例進行分析，結(jié)果顯示如下：（10.9±1.9）%（K6）、（28.0±1.4）%（K11）、（9.0±0.1%）（K27）、（3.2±0.1%）（K29）、（3.5±0.1）%（K33）、（29.1±1.9）%（K48）和（16.3±0.2）%（K63）。上述證據(jù)意外發(fā)現(xiàn)K11與目前研究較為深入的K48鏈接的泛素鏈占比相當，而目前研究知之甚少的K27泛素鏈比例也并不是最低的。這還只是單純的幾種鏈形成的比例，還沒有涉及到更加復(fù)雜的拓撲結(jié)構(gòu)、分支結(jié)構(gòu)和混合結(jié)構(gòu)。這說明對細胞內(nèi)的泛素研究仍然需要廣泛而基礎(chǔ)的研究。一個典型的例子是目前還無法用酶法來制備的K27泛素鏈。究其原因有以下兩個方面。一是K27的側(cè)鏈氨基由于處于被包埋狀態(tài)，因此活性中心不易暴露導(dǎo)致其活化難度提高。二是K27泛素鏈的E2、E3和DUB酶現(xiàn)有研究過少，使得K27泛素鏈無法通過酶促組裝進行體外合成，從而一定程度上阻礙了K27泛素鏈的結(jié)構(gòu)和功能研究。

生物酶法制備泛素鏈的優(yōu)勢在于能夠?qū)μ禺愋缘膩喕鶈卧M行特異性的修飾與標記。比如磷酸化修飾、熒光探針標記、順磁探針標記和同位素標記等等。以上這些特異性標記對于復(fù)雜泛素體系研究來說至關(guān)重要。通過特定亞基的磷酸化修飾，能夠探究磷酸化修飾對泛素局部的構(gòu)象影響。但是在磷酸化樣品的制備過程中要注意的是磷酸化對酶聯(lián)反應(yīng)體系的影響，換言之，需要注意磷酸化反應(yīng)和酶聯(lián)反應(yīng)的順序。在前文中已經(jīng)提到，磷酸化能夠影響E1、E2、E3和DUB的酶活效率。一般來說磷酸化會降低酶聯(lián)效率。因此會優(yōu)化反應(yīng)方案，此部分在前文中也已經(jīng)提到。在生物體內(nèi)，泛素鏈并沒有完全被磷酸化，有文獻顯示體內(nèi)的磷酸化水平維持在約20%左右［18］。如果需要模擬體內(nèi)的磷酸化修飾，可以不需要針對特定亞基進行磷酸化。通過對野生型泛素鏈直接進行磷酸化修飾，只需要控制反應(yīng)的酶量及時間即可。在特定亞基引入順磁探針或者熒光探針，有兩種引入方案可供選擇。一是用非天然氨基酸的方法，此種方法需要先制備帶有非天然氨基酸的亞基，然后通過生物酶法制備泛素鏈。另一種方案是先在泛素亞基上引入Cys突變，這種方案為了減少對酶聯(lián)反應(yīng)的影響，通常會選擇在生物酶法制備泛素鏈以后，然后再通過探針與Cys的反應(yīng)達到引入的目的。比如本課題組已經(jīng)成功將Alexa488（Thermo Fisher）和Cy5馬來酰亞胺（maleimide）（GE Healthcare）引入到K63-diUb或者磷酸化的K63-diUb的兩個亞基上，然后通過smFRET技術(shù)探究K63-diUb在磷酸化前后的系綜結(jié)構(gòu)差異［6，13］。用同位素分別標記泛素鏈亞基，然后通過二維或者三維核磁共振實驗研究單個泛素鏈的動力學(xué)行為和結(jié)構(gòu)特征，從而得到泛素鏈里每個亞基的構(gòu)象特征［35，48］。本課題組也通過在K63-diUb上引入順磁探針，然后通過核磁PRE（順磁弛豫增強）技術(shù)探究了K63-diUb系綜結(jié)構(gòu)的構(gòu)象分布［7］。

除了制備不同種類的泛素鏈以外，制備帶有泛素鏈修飾的底物復(fù)合體也是泛素研究的重點和難點。在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中，通常認為由E3連接酶催化泛素修飾底物的特定位點，換言之，泛素修飾底物的位置由E3泛素連接酶來確定。那么就引發(fā)了疑問：泛素是否也具有位點選擇性？底物上的Lys位點是否都能夠被泛素修飾？目前從識別機制出發(fā)很難回答這些問題。不過有研究人員通過在底物的不同Lys位點上人為引入泛素化修飾，發(fā)現(xiàn)部分敏感位點的泛素化修飾確實會破壞蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并增加了蛋白酶體降解的速度［49］。同時也有分子動力學(xué)研究表明，泛素化修飾底物以后可能會破壞底物蛋白的穩(wěn)定性，主要是通過降低底物的構(gòu)象熵導(dǎo)致的［50-51］。目前關(guān)于泛素修飾底物的動態(tài)識別機制尚需要進一步研究，這就需要對不同底物的不同位點進行定點的泛素化修飾。對于天然底物和泛素之間異肽鍵的構(gòu)建，有研究人員通過改進E1、E2和E3酶方法，成功在底物的Lys側(cè)鏈ε-氨基上引入了泛素化修飾［49］，清華大學(xué)劉磊等［52］也應(yīng)用化學(xué)合成技術(shù)對組蛋白H2B-K34位點進行泛素化修飾。無論是生物酶法還是化學(xué)合成方法，希望通過不斷的改進技術(shù)，使得底物的泛素化修飾具有更強的普適性。總的來說，無論是制備泛素鏈，還是制備泛素鏈修飾的底物復(fù)合物體，都需要化學(xué)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及細胞生物學(xué)的協(xié)同合作，從而才能夠系統(tǒng)的闡述泛素構(gòu)建的生理網(wǎng)絡(luò)。

4 結(jié) 論

本論文通過E1、E2、E3及DUB參與的方式，系統(tǒng)地闡述了不同泛素鏈的制備過程。以體外生物酶法的制備方式，能夠高效高產(chǎn)地得到實驗樣品，為后續(xù)特定亞基的特異性修飾提供了充足的保障。在目前的實驗過程中，一次酶反應(yīng)后其長度能夠達到十聚體左右，然后對不同鏈長的多聚泛素的分離純化，即可得到不同鏈長的泛素鏈。本文雖然僅對泛素磷酸化這一泛素自身的修飾作了論述，但同樣適用于制備其他翻譯后修飾的樣品，比如乙?；图谆?，當然這主要依賴于特異性修飾酶的深入研究。本文對K11/K48分支鏈的論述也同樣適用于其他分支鏈或者混合鏈的制備。通過對不同泛素形式的研究，進而全面且深入地研究泛素系統(tǒng)，對理解泛素、泛素鏈及修飾的泛素鏈在生理網(wǎng)絡(luò)中扮演的角色至關(guān)重要。