不同施肥處理閩楠幼林根系分泌物的鑒定和化感物質(zhì)分析

李振山，何功秀，董 翔，文仕知

（中南林業(yè)科技大學(xué) 水土保持與荒漠化防治湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410004）

在特定環(huán)境下，植被根系通過某種途徑釋放到根際土壤的滲出物、分泌物和排泄物稱為根系分泌物[1]。按照分子質(zhì)量，根系分泌物可分為高分子分泌物和低分子分泌物兩種，主要包括酸類、酚類、糖類和醇類等物質(zhì)，其作用以調(diào)節(jié)植被與土壤根際微生物種群或與其他有機體之間的化感作用為主[2-3]?；凶饔茫址Q為他感作用、化感效應(yīng)，最早被Rice 定義為植物或微生物通過向外界環(huán)境釋放的化學(xué)物質(zhì)，影響鄰近植物或微生物生長發(fā)育的化學(xué)生態(tài)學(xué)現(xiàn)象[4]，一般具有3 個特征：相互作用只可為植物本身或植物之間、化學(xué)物質(zhì)之間相互作用只能以某種合適途徑進入環(huán)境的植物次生物質(zhì)、影響范圍只存在于植物本身或鄰近植物的生長和發(fā)育[5]。根系分泌物中的化感物質(zhì)已被證實對作物和林木產(chǎn)生影響，導(dǎo)致連作經(jīng)濟作物的產(chǎn)量與品質(zhì)下降以及連作經(jīng)營林木的地力衰退[6-10]，因此依據(jù)植物根系分泌物的功能和機理，開展對化感物質(zhì)的研究與利用，已成為近年來土壤和生態(tài)學(xué)研究的熱點領(lǐng)域。

閩楠Phoebe bournei俗稱楠木，屬于樟科楠木屬的高大喬木，是我國Ⅱ級珍稀漸危種，主要分布在華中、華南地區(qū)的福建、湖南、江西以及廣東和廣西等省區(qū)，其優(yōu)質(zhì)的材質(zhì)可以制作高質(zhì)量的家具、建筑和雕刻，具有極高的經(jīng)濟和觀賞價值[11]。近年來，對野生閩楠的大規(guī)?？撤?，導(dǎo)致資源日趨衰竭，人工林的栽培技術(shù)引起廣大學(xué)者重視[12]。相關(guān)文獻記載，施有機肥、氮肥、磷肥、鉀肥等不同配方施肥均可顯著提升閩楠幼林的生長量[13-14]，因此施肥處理對其生長發(fā)育顯得尤為重要。

林木的施肥效應(yīng)除了受土壤、林木本身的營養(yǎng)特性、施肥量的影響外，還與施肥類型有關(guān)[15]。目前，對于閩楠施肥的研究方向主要集中在單一肥料的不同配方施肥，對不同類型施肥的研究尚鮮見報道。為此，本試驗以有機肥、復(fù)合肥和菌肥為供試原料，開展了3 種施肥處理下閩楠幼林根系分泌物的成分檢測的研究，旨在為選擇合適的施肥措施，揭示5年生閩楠幼林根系分泌物的主要成分及化感物質(zhì)，提升閩楠開發(fā)利用價值，為閩楠人工林的栽培經(jīng)營提供數(shù)據(jù)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)選取在湖南省祁陽縣的金洞林場，地處南嶺山系陽明山脈東北部，湘江中上游，總面積635 km2。地理位置為112°04′30″E，26°18′30″N，海拔高度193 m。屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)，年平均氣溫17.6～18.6℃，一年中最低氣溫0℃以下只有8～15 d。多年平均降雪日數(shù)為3～7 d，極端最低氣溫在-4.9～8.4℃之間。年均降水量1 300～1 740 mm，太陽總輻射量達101.5～113 kcal/cm2。林場地貌以砂巖、頁巖、碳質(zhì)板巖為主，土層深厚肥沃，有機質(zhì)含量較高。林場內(nèi)森林茂盛，物種多樣，有高等植物210 科，1 557 種，種子植物中有木本植物98 科，654 種，覆蓋率達89.4%。

1.2 樣地設(shè)置

本試驗林地是2013年營造的閩楠純林，其種植密度為2.5 m×2.5 m。2018年9月份對閩楠幼林進行施肥，共設(shè)置4 種施肥處理：有機肥處理，復(fù)合肥處理，菌肥處理，不施肥處理（對照組）。其中，有機肥主要成分氮磷鉀≥5%，有機質(zhì)≥45%；復(fù)合肥主要成分氮磷鉀的百分比均為15%，總養(yǎng)分≥45%；菌肥主要成分復(fù)合芽孢桿菌，活菌≥200 億/g。選取立地條件相同且生長狀況相近的5年生閩楠幼林作為試驗區(qū)，每種處理設(shè)置3 塊20 m×20 m 的標準樣地，共計12 塊。其中，有機肥施用量1 kg/株；復(fù)合肥施用量400 g/株，菌肥施用量20 g/株。施肥方式為環(huán)施。表1為試驗區(qū)標準地樣地概況。

表1 不同標準地的樣地概況Table 1 Sample plots of different standard plots

1.3 根系分泌物的收集和鑒定方法

于2018年12月對12 塊閩楠幼林樣地進行每木檢尺，記錄并計算每個樣地的平均地徑，選取與平均地徑相接近的3 株植株，各取500 g 根系并混合，抖凈根系表面土壤，放入盛有冰袋的泡沫箱帶回實驗室。根系用自來水小水流沖洗干凈，加入少量百里酚（抑制微生物）后再用新制去離子水浸泡5 min 并沖洗3 次，放置在裝有300 mL 0.5 mmol/L乙酸乙酯溶液的廣口瓶中，用錫箔紙包裹廣口瓶，使根系處在黑暗狀態(tài)，收集過程連續(xù)通氣，收集24 h。濾紙過濾后將得到的根系分泌物減壓濃縮至20 mL（濃縮15 倍），于-20℃冰箱保存待上機檢測。

對乙酸乙酯溶劑提取的根系分泌物進行鑒定：采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight tandem mass spetrometry,UPLC-QTOF-MS/MS），流動相采用乙腈-水體系，即用乙酸乙酯將樣品稀釋10 倍后取樣品100 μL于離心管中，后加入乙酸乙酯900 μL；樣品于4℃，15 000 g 條件下離心10 min，取上清，過0.22 μm濾膜，備檢。液相條件：時間梯度為0、30.0、35.0、35.1 和40.0 min，流速為0.3 mL/min，H2O+0.1%FA 為95%，ACN+0.1%FA 為5% 和100%。質(zhì)譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7×2.1×50 mm Column，來源為ESI，質(zhì)量范圍在50～1 200 Da，干燥氣體（N2）設(shè)置為8.0 L/min，干燥溫度設(shè)定220℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

閩楠幼林根系分泌物經(jīng)UPLC-QTOF-MS/MS檢測后，采用化合物譜庫（NISI107）進行分析，得出各峰的物質(zhì)和匹配度，統(tǒng)計各峰匹配度大于90%的物質(zhì)，并參考保留時間確定物質(zhì)，利用Excel 2016 軟件制表和統(tǒng)計分析。使用色譜峰面積歸一化法對閩楠幼林根系分泌物進行定量分析。使用Origin 2017 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理閩楠幼林根系分泌物的鑒定結(jié)果

經(jīng)UPLC-QTOF-MS/MS 分析得到不同施肥處理的閩楠細根根系分泌物總離子色譜圖，每種處理設(shè)3 個重復(fù)，共鑒定出化學(xué)成分111 種，其中有機肥處理（圖1）共檢測出96 種化學(xué)成分，復(fù)合肥處理（圖2）共檢測出94 種化學(xué)成分，菌肥處理（圖3）共檢測出94 種化學(xué)成分，不施肥處理（圖4）共檢測出85 種化學(xué)成分。取相對含量大于1%的主要化學(xué)成分制表統(tǒng)計，其中有機肥處理（表2）檢測出的主要物質(zhì)有八氫四甲基萘甲醇（14.67%）、磷酸（12.37%）、長葉蒎烯（10.63%）、網(wǎng)翼藻烯（6.3%）、C16-二氫鞘氨醇（6.12%）、喇叭茶醇（5.29%）等；復(fù)合肥處理（表3）檢測出的主要物質(zhì)有磷酸（15.1%）、八氫四甲基萘甲醇（13.16%）、長葉蒎烯（11.18%）、C16-二氫鞘氨醇（7.31%）、二氫鞘氨醇（4.81%）、網(wǎng)翼藻烯（4.76%）等；菌肥處理（表4）檢測出的主要物質(zhì)有磷酸（27.27%）、八氫四甲基萘甲醇（9.62%）、長葉蒎烯（8.94%）、C16-二氫鞘氨醇（8.24%）、正環(huán)乙烯羰基十五烷基胺（7.06%）、二氫鞘氨醇（5.37%）等；不施肥處理（表5）檢測出的主要物質(zhì)有磷酸（17.28%）、八氫四甲基萘甲醇（12.97%）、C16-二氫鞘氨醇（8.87%）、正環(huán)乙烯羰基十五烷基胺（8.14%）、長葉蒎烯（6.61%）等。由表2～3可以看出，有機肥和復(fù)合肥處理的根系分泌物中，萜烯類和萜醇類化合物的相對含量較高，酸類化合物其次；而菌肥處理（表4）酸類和萜烯類化合物的相對含量較高，脂類和萜醇類化合物其次；對照處理則是萜烯類、脂類、胺類和酸類化合物的相對含量均較高。

圖1 有機肥處理閩楠幼林根系分泌物總離子流色譜圖比較Fig.1 Comparison of total ion current chromatograms of root exudates of Phoebe bournei seedling forest treated with organic fertilizer

圖2 復(fù)合肥處理閩楠幼林根系分泌物總離子流色譜圖比較Fig.2 Comparison of total ion flow chromatogram of root exudates of Phoebe bournei seedling forest treated with compound fertilizer

圖3 菌肥處理閩楠幼林根系分泌物總離子流色譜圖比較Fig.3 Comparison of total ion current chromatogram of root exudates of Phoebe bournei seedling forest treated with bacterial manure

圖4 不施肥處理（對照）閩楠幼林根系分泌物總離子流色譜圖比較Fig.4 Comparison of total ion current chromatogram of root exudates of Phoebe bournei seedling forest without fertilization treatment (CK)

表2 有機肥處理閩楠幼林根系分泌物的主要物質(zhì)成分Table 2 Main components of root exudates from seedling Phoebe bournei forest treated with organic fertilizer

表3 復(fù)合肥處理閩楠幼林根系分泌物的主要物質(zhì)成分Table 3 Main components of root exudates of Phoebe bournei seedling forest treated with compound fertilizer

續(xù)表3Continuation of table 3

表4 菌肥處理閩楠幼林根系分泌物的主要物質(zhì)成分Table 4 Main components of root exudates of Phoebe bournei seedling forest treated with bacterial fertilizer

表5 不施肥處理（對照）閩楠幼林根系分泌物的主要物質(zhì)成分Table 5 Main components of root exudates of Phoebe bournei seedling forest without fertilization treatment (control check)

2.2 不同施肥處理閩楠幼林根系分泌物的質(zhì)量分析

不同施肥處理閩楠根系分泌物分離出的化學(xué)成分見圖5，共包括萜烯類13 種、萜醇類12 種、堿類12 種、多肽9 種、酮類7 種、酸類6 種、酚類5 種、苯類5 種、脂類4 種、呋喃3 種、糖苷3 種、醌類2 種、嘌呤1 種、噻唑1 種、嘧啶1 種、吡啶1 種、烷烴1 種。其中相對含量較高的萜烯類化合物典型組分有長葉蒎烯、網(wǎng)翼藻烯，萜醇類化合物典型組分有八氫四甲基萘甲醇、喇叭茶醇，酸類化合物包括乙?；?、鼠尾草酸、羅漢松酸、肉桂單寧、β-香樹脂醇和磷酸。與對照組相比，施有機肥提高了萜烯類、萜醇類、堿類、多肽類、酮類、酚類、苯類和醌類的數(shù)量，降低了糖苷類的物質(zhì)數(shù)量；施復(fù)合肥提高了萜烯類、萜醇類、堿類、多肽類、酚類、苯類和醌類物質(zhì)的數(shù)量，降低了糖苷類、呋喃類和酮類物質(zhì)數(shù)量；施菌肥提高了萜醇類、胺類、堿類、多肽類、酚類和苯類物質(zhì)數(shù)量，降低了酯類和呋喃類物質(zhì)數(shù)量。

圖5 不同施肥處理閩楠幼林根系分泌物化學(xué)成分種類的數(shù)量Fig.5 Number of chemical components in root exudates of Phoebe bournei seedling forest under different fertilization treatments

不同施肥處理的化學(xué)成分種類及其相對含量如圖6所示。與對照組相比，施肥提高了閩楠根系分泌物中萜烯類、萜醇類和堿類化合物的相對含量，降低了脂類、胺類、噻唑類和呋喃類物質(zhì)的相對含量；有機肥和復(fù)合肥均降低了酸類、酮類和呋喃類物質(zhì)的相對含量，而菌肥則提高了這3種物質(zhì)的相對含量。

與對照組（表5）相比，有機肥處理（表2）提高了根系分泌物中16 種物質(zhì)的相對含量，降低了19 種物質(zhì)的相對含量；復(fù)合肥處理（表3）提高了19 種物質(zhì)的相對含量，降低了16 種物質(zhì)的相對含量；菌肥處理（表4）提高了24 種物質(zhì)的相對含量，降低了10 種物質(zhì)的相對含量。每個處理組相對含量最高的6 種化學(xué)成分比較如圖7所示。有機肥處理的閩楠根系中相對含量大于1%的共檢測出22 種，八氫四甲基萘甲醇、網(wǎng)翼藻烯和喇叭茶醇比其他處理組高，比不施肥處理分別高1.7%、4.1%和3.5%（圖7A）。復(fù)合肥處理的閩楠根系中相對含量大于1%的共檢測出19 種，長葉蒎烯比其他組高，比不施肥處理高4.57%（圖7B）。菌肥處理的閩楠根系中相對含量大于1%的共檢測出29 種，磷酸比其他處理組高，比不施肥處理高9.99%（圖7C）。對照組的閩楠根系中相對含量大于1%的共檢測出19 種，C16-二氫鞘氨醇、二氫鞘氨醇和正環(huán)乙烯羰基十五烷基胺的相對含量均高于其他處理組（圖7D）。因此，不同施肥處理可以用來提高或降低根系分泌物中某些成分的相對含量，可用于植被化感效應(yīng)的定向研究與利用。

圖7 不同施肥處理閩楠幼林根系分泌物化學(xué)成分種類及相對含量Fig.7 Chemical composition and relative content of root exudates of Phoebe bournei seedling forest under different fertilization treatments

3 討 論

根系分泌物是植物根系釋放至根際環(huán)境中的有機物質(zhì)的總稱，是根際沉積的重要組成部分，其組成與含量主要受不同的土壤類型和根際周圍的環(huán)境因素中微生物的降解作用的影響[8]。植物根系分泌物主要包括有機酸、肉桂酸及其衍生物、脂肪族醛和酮、直鏈醇、簡單不飽和內(nèi)酯、萘醌、蒽醌和復(fù)合醌、簡單酚、香豆素類、類萜和甾類化合物、氨基酸和多肽、類黃酮、單寧、長鏈脂肪酸和多炔、生物堿和氰醇、苯甲酸及其衍生物、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等[16-19]。4 種（施有機肥、施復(fù)合肥、施菌肥、對照）處理分別檢測出96、94、94、85 種化合物，主要為：長葉蒎烯、八氫四甲基萘甲醇、C16-二氫鞘氨醇、磷酸和正環(huán)乙烯羰基十五烷基胺。其中相同的成分有72 種，多數(shù)為萜烯類和萜醇類化合物。該結(jié)果表明施肥處理不會使閩楠根系分泌物的種類發(fā)生大幅度的變化。此外，除施加菌肥時磷酸含量顯著高于另外3 種施肥處理外，其他處理中閩楠幼林主要的根系分泌物含量均無顯著差異。相關(guān)研究表明，根系分泌物可以活化磷酸鈣和磷酸鋁鹽等土壤中的難溶性磷素，以提高根際有效磷的濃度，供植被吸收與利用[20-21]。本研究檢測出的主要酸類化合物為磷酸，有機肥和復(fù)合肥的施加均降低了其相對含量，但菌肥處理的磷酸相對含量達到了27.65%，顯著高于其他3 種處理（12.37%、15.10%、17.28%），表明菌肥的施用可能促進了根系分泌物對土壤中難溶性磷素的活化作用，可以提高閩楠幼林對有效磷的吸收利用。

植物通過根系自身分泌、淋溶、揮發(fā)和微生物腐解作用等方式將根系分泌物釋放到周圍環(huán)境中，影響植物根系對土壤養(yǎng)分的吸收與利用[1]，其中很多根系分泌物被鑒定為化感物質(zhì)。韋瑋[22]使用GC-MS 乙醇浸提法對一二代馬尾松人工林根際土壤浸提物進行化學(xué)成分鑒定，檢測出的化合物以酸類和酯類為主，推斷出的化感物質(zhì)有2,4-二叔丁基苯酚、棕櫚酸和（Z）-9-十八烯酸酰胺等。張汝民等[23]使用GC-MS 乙酸乙酯萃取法對梭梭幼苗根系分泌物進行成分鑒定，檢測到30 余種化合物，包括酚醌類、醛酮類、醇類、酸類、脂類和胺類化合物，化感物質(zhì)以醇類化合物為主。劉欣宇等[24]對木欖幼苗根系分泌物采用GC-MS 的乙酸乙酯和二氯甲烷提取劑提取鑒定，檢測出烴類、酯類和酚類化合物40 種，化感物質(zhì)以烴類以不飽和脂肪烴為主。本研究中4 種施肥處理的萜烯類和萜醇類化合物總相對含量分別為49.27%、44.3%、35.13%和31.98%，在鑒定出的根系分泌物所占比例最高。相關(guān)研究表明，萜類物質(zhì)所產(chǎn)生的化感作用會抑制人參Panax ginseng、白樺Betula platyphylla等植物的生長發(fā)育[25-26]。影響種子萌發(fā)和幼苗生長，杉木Cunninghamialanceolata、蒼術(shù)Atractylodes lancea和燈心草Juncus effusus等植被根系分泌的萜類物質(zhì)能引起強烈的自毒作用[27-29]。但也有文獻記載，植被分泌出的多種萜類化合物之間存在協(xié)同作用，當(dāng)某種植被在群落中數(shù)量較少時，會產(chǎn)生刺激性的萜類物質(zhì)加速其繁殖與生長[30-32]。本研究中有機肥與復(fù)合肥處理均顯著提高了根系分泌物中萜類物質(zhì)的相對含量，且有機肥處理的相對含量更高，但起到的是抑制還是促進作用有待后續(xù)試驗認證。

酸性物質(zhì)是植物根系分泌物的主要成分之一，在植物生長中回收利用有機磷酯類中的P 元素等作用[1]。羅曉曼[33]在菌根化馬尾松苗木中使用GC-MS 乙醇浸提法鑒定出根系分泌物十余種，其中酸類占比較大；非菌根化苗木中檢測出20 余種，酸類和酯類占比較大。段劍[34]使用GC-MS 乙酸乙酯浸提檢測法對馬尾松和楓香的根系分泌物進行化學(xué)成分鑒定，同樣檢測出酸類物質(zhì)的相對含量較高；檢測出的其他物質(zhì)分屬于烴、醇、醛、酮、酸、酯、酚和酰胺類。董哲[35]對沙棘根系分泌物中的酸類物質(zhì)使用GC-MS 乙醚萃取檢測法檢測出了10 余種酸性物質(zhì)，結(jié)果顯示苯甲酸和乙酸分別與酚酸和有機酸最為相關(guān)。王延平等[9]使用UPLC 法對楊樹幼苗酚酸類根系分泌物進行鑒定，檢測出了羥基苯甲酸、香草醛、苯甲酸和肉桂酸等物質(zhì)。本研究中在不同施肥處理的檢測結(jié)果中，酸類物質(zhì)的相對含量同樣占據(jù)較高的比例，分別為13.4%、16.05%、28.17%和18.02%。

目前，我國對于閩楠等樟科樹種的研究已經(jīng)較為深入，包含了育苗育種、栽培經(jīng)營、精油提取、成分鑒定、微生物多樣性等方面[36-38]。未來對閩楠根系分泌物還可以在以下幾個方面深入研究：一是本研究主要根系分泌物萜烯類化合物是否為化感物質(zhì)，是否影響閩楠幼林生長發(fā)育需要進一步的試驗探究；二是重金屬元素尤其是鎘元素對閩楠幼林根系分泌物的影響較大，而湖南省土壤鎘元素含量普遍較高，因此重金屬是否會對閩楠幼林根系分泌物產(chǎn)生影響，如何影響閩楠生長有待進一步驗證；三是閩楠幼林-根系分泌物-土壤微生物之間的聯(lián)系有待深入研究。

4 結(jié) 論

本研究利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜，使用乙酸乙酯溶劑對閩楠幼林進行根系分泌物的成分檢測，不同施肥處理（有機肥、復(fù)合肥、菌肥）和對照組分別檢測出96、94、94、85 種化合物，典型組分為：長葉蒎烯、網(wǎng)翼藻烯、八氫四甲基萘甲醇、二氫鞘氨醇、C16-二氫鞘氨醇、喇叭茶醇、磷酸和正環(huán)乙烯羰基十五烷基胺，其中萜類物質(zhì)在鑒定出的化合物類型中所占比例最高。除施加菌肥時磷酸含量顯著高于另外3 種施肥處理外，其他處理中閩楠幼林主要的根系分泌物含量均無顯著差異。不同施肥處理的閩楠根系分泌物中物質(zhì)及組分類型存在差異；提高或降低根系分泌物中某些成分的相對含量，可用于植物化感效應(yīng)的定向研究與利用。