一株產(chǎn)細(xì)菌素乳桿菌的鑒定及其 細(xì)菌素編碼基因的獲得

吳 軼，貢漢生*，劉文麗，李明月，王華東，王俊娟

一株產(chǎn)細(xì)菌素乳桿菌的鑒定及其 細(xì)菌素編碼基因的獲得

吳 軼，貢漢生*，劉文麗，李明月，王華東，王俊娟

（魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺 264025）

應(yīng)用雙層平板打孔法，從自制櫻桃酒里分離的乳桿菌中篩選到一株對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有明顯抑制作用的菌株，命名為LD 1.0008。通過API 50 CHL糖發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、16S rDNA基因序列分析及其特異性recA基因多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），鑒定LD 1.0008為植物乳桿菌。排除有機(jī)酸的干擾，用多種蛋白酶處理后，其抑菌活性均有明顯降低，而用過氧化氫酶處理后其抑菌活性基本不變，從而確定LD 1.0008所產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。使用已報(bào)道的10 對植物乳桿菌細(xì)菌素基因片段設(shè)計(jì)的引物對菌株LD 1.0008進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其至少含有4 個植物乳桿菌素相關(guān)編碼基因，即plnD、plnO、plnV和plnW。

細(xì)菌素；乳桿菌；鑒定；細(xì)菌素編碼基因

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程中合成并分泌到環(huán)境中的一類對同種或親緣關(guān)系較近的微生物有殺滅或抑制作用的蛋白質(zhì)或多肽物質(zhì)[1]。細(xì)菌素的抑菌作用具有廣譜性、穩(wěn)定性和無毒性等特點(diǎn)，且加入食品后不影響食品的感官性狀。目前已成功應(yīng)用于乳制品、肉制品、罐裝蔬菜、果汁、酒精飲料及葡萄酒的釀造等[2-5]。Nisin早在1998年已被50多個國家和地區(qū)允 許作為食品防腐劑，并在乳制品和罐頭制品中廣泛使用[6]。

植物源乳酸菌的研究正日益得到重視。來源于植物的植物乳桿菌可產(chǎn)生多種植物乳桿菌素，抑制其他微生物的生長，多數(shù)植物乳桿菌素屬于Ⅰ類或Ⅱ類細(xì)菌素，具有分子質(zhì)量較小、熱穩(wěn)定性高、可被蛋白酶降解的特點(diǎn)，主要抑制乳酸菌和其他革蘭氏陽性細(xì)菌，此外，據(jù)報(bào)道BacTN365等還能抑制革蘭陰性菌和霉菌的生長[7-8]。同時植物乳桿菌素的作用方式一般為殺菌和溶菌[9]，由于其自身的特性以及伴隨菌株在發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的保健功效，使植物乳桿菌素具有廣泛的應(yīng)用前景。產(chǎn)植物乳桿菌素的菌株主要從乳制品、植物原材料或發(fā)酵食品中

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

從自制櫻桃酒中分離出的34 株乳桿菌中篩選出1 株具有明顯抑菌活性的菌株，暫命名為LD 1.0008。指示菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922。

乳桿菌培養(yǎng)選用改良MRS培養(yǎng)基 英國Oxoid公司；指示菌培養(yǎng)選用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星公司。

過氧化氫酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶美國Sigma公司；蛋白酶K 美國Amresco公司；木瓜蛋白酶 德國AB Enzymes公司；PCR Master Mix 立陶宛Thermo Scientifi c公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科技儀器廠；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；SC850型凝膠成像系統(tǒng) 上海山富科學(xué)儀器有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備

參考貢漢生等[11]的方法制備細(xì)菌素的無細(xì)胞發(fā)酵上清液，將菌株在30 ℃條件下靜置培養(yǎng)到穩(wěn)定期（OD600nm≥1.9），12 000×g、4 ℃離心15 min收集上清液，用3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.5，排除有機(jī)酸的干擾。上清液用0.22 μm濾膜過濾后冷凍干燥濃縮，凍干后加入原體積1/10的滅菌超純水，溶解后放入-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 具有抑菌活性菌株的篩選

采用雙層平板打孔法[12]篩選具有抑菌活性的菌株，指示菌選用金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌。

1.3.3 菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的初步鑒定

取等量無細(xì)胞發(fā)酵上清液（pH 6.5），使用3 mol/L HCl溶液和3 mol/L NaOH溶液分別調(diào)pH值至以下各酶最適pH值，將終濃度1 mol/mL的過氧化氫酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分別加入無細(xì)胞發(fā)酵上清液中，37 ℃條件下培育2 h。將pH值調(diào)回到6.5，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，用凍干濃縮相同倍數(shù)的改良MRS培養(yǎng)基與無細(xì)胞發(fā)酵上清液做相同處理后作為對照。篩選得到[7,10]，本實(shí)驗(yàn)旨在從自制櫻桃酒中分離出具有高抑菌活性細(xì)菌素的乳桿菌，對產(chǎn)生細(xì)菌素的乳桿菌進(jìn)行鑒定并獲得其所產(chǎn)細(xì)菌素的編碼基因，為植物乳桿菌素應(yīng)用于食品防腐保鮮提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.3.4 糖發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)

挑取活化好的菌株4 500×g離心10 min，用2 mL無菌生理鹽水重懸菌體制成細(xì)胞懸液。根據(jù)API 50 CHL系統(tǒng)說明書操作。將結(jié)果輸入系統(tǒng)測定軟件API plus中，通過歸納菌株可發(fā)酵糖的種類初步確定其歸屬的種類。

1.3.5 16S rDNA基因和recA基因的PCR擴(kuò)增及測序

依據(jù)試劑盒說明書方法提取菌株LD 1.0008基因組DNA。使用乳桿菌16S rDNA基因通用引物[13]和recA基因的特異性引物[14]擴(kuò)增，引物序列如表1所示。16S rDNA基因和recA基因的PCR反應(yīng)體系均為50 μL。16S rDNA擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸90 s，35 個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。recA基因擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s、55 ℃復(fù)性45 s、72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。反應(yīng)完畢后分別取5 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。PCR產(chǎn)物送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化后測序。得到的PCR產(chǎn)物序列通過BLAST在GenBank中進(jìn)行同源性比較，并將其鑒定到種。

表1 16S rDNA基因和rreeccAA基因的PCR擴(kuò)增引物和條件Table 1 PCR primers used for 16S rDNA sequence analysis andrrecAbsd PCR

1.3.6 植物乳桿菌所產(chǎn)細(xì)菌素編碼基因的獲得

表2 植物乳桿菌素的PCR擴(kuò)增引物和條件Table 2 PCR primers and thermal cycling conditions for the detection of plantariicciinn

如表2所示，根據(jù)已報(bào)道的植物乳桿菌素相關(guān)基因選擇10 對引物，PCR擴(kuò)增菌株LD 1.0008中可能含有的植物乳桿菌素相關(guān)基因，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果及其菌落特征

從自制櫻桃酒中分離出的34 株乳桿菌，以金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌為指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以抑菌圈直徑＞10 mm記為具有抑菌活性，從34 株乳桿菌中篩選出一株對兩種指示菌均有明顯抑菌活性的菌株，命名為LD 1.0008。

菌株LD 1.0008的菌落特征：在改良MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)36 h后菌落直徑大小為1.5 mm左右，光滑、濕潤、圓形、突起、呈乳白色、不透明、邊緣整齊。

菌株LD 1.0008的菌體特征：短桿、呈單個均勻散落、革蘭氏陽性、著色均勻。

2.2抑菌物質(zhì)初步鑒定結(jié)果

將無細(xì)胞發(fā)酵上清液調(diào)pH值至6.5，排除了有機(jī)酸的干擾，經(jīng)各種酶處理后發(fā)酵上清液的抑菌效果如表3所示。經(jīng)過氧化氫酶處理后，發(fā)酵上清液的抑菌效果與未經(jīng)處理的對照組相差不大，可排除過氧化氫的干擾；而經(jīng)胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶處理后，無細(xì)胞發(fā)酵上清液的抑 菌圈顯著減小，從而確定該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類細(xì)菌素。

表3 酶處理后的抑菌效果Table 3 Antibacterial activity after enzymatic treatments

2.3糖發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按照API 50 CH試劑條使用說明，采用API 50 CHL培養(yǎng)基對菌株LD 1.0008進(jìn)行49 種碳水化合物的發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。將表4中的鑒定結(jié)果用API plus軟件進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，菌株LD 1.0008與植物乳桿菌有66%的同源性，與戊糖乳桿菌有34%的同源性。

表4 LD 1.0008的API 50 CHL反應(yīng)結(jié)果Table 4 Carbohydrate utilization of LD 1.0008 using API 50 CHL

2.4 16S rDNA基因與recA基因的鑒定結(jié)果

通過對菌株LD 1.0008的16S rDNA基因和recA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別獲得了大小為1 479 bp和287 bp的基因片段，如圖1所示，將所得序列在BLAST軟件上與已知菌株的16S rDNA序列和recA序列進(jìn)行同源性對比，結(jié)果表明菌株LD 1.0008的16S rDNA序列與GenBank中植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和亞利桑那乳桿菌的16S rDNA序列同源性均達(dá)到99%以上。

圖1 16S rDNAA與rreeccAA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA andrecAgenes

LD 1.0008的recA基因序列與植物乳桿菌的recA基因序列有99%的同源性，與亞利桑那乳桿菌的recA基因序列有94%的同源性，與戊糖乳桿菌的部分recA基因序列有88%的同源性，據(jù)此判定菌株LD 1.0008為植物乳桿菌。

2.5產(chǎn)植物乳桿菌素編碼基因的獲得

使用10 對已報(bào)道的乳桿菌素引物分別對菌株LD 1.0008基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用plnD、plnO、plnV和plnW的引物擴(kuò)增出現(xiàn)了基因條帶，PCR產(chǎn)物純化后測序，分 別得到382、189、710、728 bp的基因片段，在GenBank中進(jìn)行基因序列比對，4 條基因序列與plnD、plnO、plnV和plnW部分基因序列的同源性都達(dá)到99%以上，據(jù)此可推斷植物乳桿菌LD 1.0008可產(chǎn)生多種植物乳桿菌素。

圖2 乳桿菌素編碼基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR amplification of plantaricin genes

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)篩選得到一株對革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有抑制作用的乳桿菌LD 1.0008。通過API 50 CHL生化鑒定、16S rDNA基因序列分析及其特異性recA基因多重PCR反應(yīng)，最終鑒定該菌為植物乳桿菌。使用已報(bào)道的10 對根據(jù)植物乳桿菌素基因片段設(shè)計(jì)的引物，對菌株LD 1.0008進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其至少含有4 個植物乳桿菌素相關(guān)編碼基因：plnD、plnO、plnV和plnW。與目前國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的高產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌相比，LD 1.0008產(chǎn)生的細(xì)菌素種類多，可同時抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌，且可被多種蛋白酶水解，不會對人體造成傷害，這對于分離LD 1.0008產(chǎn)生的植物乳桿菌素并將其應(yīng)用于食品防腐保鮮具有重要意義。

[1]趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究[M].北京:科學(xué)出版社, 2007: 66-67.

[2] PEREZ R H, HIMENO K, ISHIBASHI N, et al. Monitoring of the multiple bacteriocin production by Enterococcus faecium NKR-5-3 through a developed liquid chromatography and mass spectrometrybased quantification system[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2012, 114(5): 490-496.

[3] MALDONADO-BARRAGáN A, CABALLERO-GUERRERO B, LUCENA-PADRóS H, et al. Induction of bacteriocin production by coculture is widespread among plantaricin-producing Lactobacillus plantarum strains with different regulatory operons[J]. Food Microbiology, 2013, 33(1): 40-47.

[4]方佳琪,別懷周,陳曉琳,等.細(xì)菌素的制備及其應(yīng)用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2011(8): 755-760.

[5] PAPAGIANNI M, SERGELIDIS D. Effects of the presence of the curing agent sodium nitrite, used in the production of fermented sausages, on bacteriocin production by Weissella paramesenteroides DX grown in meat simulation medium[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2013, 53(1): 1-5.

[6]李平蘭,張?bào)?江漢湖.乳酸菌細(xì)菌素研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào), 1998, 25(5 ): 295-298.

[7]陳一然,張明.植物乳桿菌細(xì)菌素的研究與應(yīng)用[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 23(9): 853-856.

[8] CAPLICE E, FITZGERALD G F. Food fermentations: role of microorganismsin food production and preservation[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 50(1/2): 131-149.

[9]貢漢生,孟祥晨.乳酸菌細(xì)菌素分類與作用機(jī)制[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(1): 105-109.

[10] ZHAO Shanshan, ZHANG Qiuxiang, HAO Guangfei, et al. The protective role of glycine betaine in Lactobacillus plantarum ST-III against salt stress[J]. Food Control, 2014, 44: 208-213.

[11]貢漢生,孟祥晨. 1株產(chǎn)細(xì)菌素乳桿菌的鑒定及其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的特性[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào):理學(xué)版, 2008, 43(7): 33-39.

[12] SCHILLINGER U, LüCKE F K. Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55(8): 1901-1906.

[13] SCARPELLINI M, DIEGO M, SILVIA C, et al. Development of genus/species-specific PCR analysis for identification[J]. Current Microbiology, 2002, 45(1): 24-29.

[14] TORRIANI S, FELIS G E, DELLAGLIO F. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA genederived primers[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(8): 3450-3454.

[15] DIEP D B, H?VARSTEIN L S, NES I F. Characterization of the locus responsible for the bacteriocin production in Lactobacillus plantarum C11[J]. Journal of Bacteriology, 1996, 178(15): 4472-4483.

[16] REMIGER A, EHRMANN M A, VOGEL R F. Identification of bacteriocin-encoding genes in lactobacilli by polymerase chain reaction (PCR)[J]. Systematic and Applied Microbiology, 1996, 19(1): 28-34.

[17] SáENZ Y, ROJO-BEZARES B, NAVARRO L. Genetic diversity of the pln locus among oenological Lactobacillus plantarum strains[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 134: 176-183.

Identification of a Bacteriocin-Producing Lactobacillus and Acquisition of Bacteriocin-Encoding Genes

WU Yi, GONG Hansheng*, LIU Wenli, LI Mingyue, WANG Huadong, WANG Junjuan
(College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

OneLactobacillusstrain isolated from homemade cherry wine revealed significant inhibitory activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria using double plate punching method, which was named LD 1.0008. LD 1.0008 was identified asLactobacillus plantarumby its carbohydrate fermentation pattern using API 50 CHL test kits, 16S rDNA sequence analysis andrecA-based polymerase chain reaction (PCR) test. The antibacterial activity was significantly decreased after protease treatment, whereas it remained stable after treatment with catalase. The antibacterial substances were confirmed as bacteriocin after excluding the interference of organic acid. PCR amplification was carried out using previously reported 10-pair plantaricin primers. It was indicated that at least 4 bacteriocin-encoding genes could be produced by LD 1.0008, includingplnD,plnO,plnVandplnW. It is of great significance for the separation and application of plantaricins of LD 1.0008.

bacteriocin; Lactobacillus; identifi cation; bacteriocin-encoding genes

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201511021

2014-07-01

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301565）；山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（ZR2012CQ009）；煙臺市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012125）；魯東大學(xué)科研基金項(xiàng)目（LY2010016）

吳軼（1993—），男，本科生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：mbb_wuyi@163.com

*通信作者：貢漢生（1981—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：hsgong_221@163.com