RASGRF1基因遺傳多態(tài)性與甘肅地區(qū)近視易感性的相關(guān)性

汪向利 楊麗媛 金庸 李培強 丁韻涵 謝小冬 楊君

作者單位：1 甘肅省人民醫(yī)院眼視光中心，蘭州 700030；2 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000

近視是全球性的公共衛(wèi)生問題，近視的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wide association studies,GWAS）以及高通量測序等遺傳學(xué)方法確定了與發(fā)生高度近視相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism,SNP）。GWAS研究發(fā)現(xiàn)染色體區(qū)域15q25與近視的發(fā)生顯著相關(guān)，其中位于

RASGRF1

基因的多個SNPs與屈光不正、近視或等效球鏡度（SE）相關(guān)聯(lián)。

RASGRF1

基因與近視的相關(guān)性在歐洲、美國、澳大利亞和亞洲人群中得到驗證，但也有研究報道白種人和亞洲人中并沒有發(fā)現(xiàn)此種相關(guān)性。因此

RASGRF1

基因與近視的相關(guān)性需要進一步在不同人群中進行驗證。近年來，隨著“DNA 元件百科全書”計劃(Encyclopedia of DNA elements,ENCODE)和表觀組路線圖計劃 (Roadmap epigenomics mapping consortium，Roadmap)及基因型組織表達數(shù)據(jù)庫（Genotype-tissue expression，GTEx）等計劃的實施，為促進基因非編碼區(qū)調(diào)控元件和功能性SNPs研究奠定了基礎(chǔ)。本研究根據(jù)ENCODE確定的人眼組織中RASGRF1 候選順式調(diào)控元件(Candidate cis-Regulatory Elements,ccREs)，并通過GTEx數(shù)據(jù)確定與目的基因表達相關(guān)且最小等位基因頻率（Minor allele frequency,MAF）高于10%的SNPs，進而在甘肅地區(qū)近視人群中進行病例對照分析，分析候選SNPs與近視發(fā)生的相關(guān)性，探討

RASGRF1

影響近視發(fā)生風(fēng)險的可能分子機制。

1 對象與方法

1.1 對象

選取2018年1月至2019年1月在甘肅省人民醫(yī)院眼視光學(xué)中心就診的258例無親緣關(guān)系的近視患者，根據(jù)近視程度分級標(biāo)準(zhǔn)進行分組，其中高度近視組（雙眼-10.00 D＜SE≤-6.00 D）166例（332眼）和中低度近視組92 例（184 眼） （雙眼或單眼-6.00 D＜SE≤-0.75 D），并將77例（154眼）無近視的課題志愿者作為正常對照組。本研究遵循赫爾辛基宣言，經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)（批號：2018-103），所有參與患者均知情同意，所有研究操作符合規(guī)定。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～23 歲；②近視和散光患者，球鏡度＞-10.00 D，柱鏡度數(shù)＞-2.00 D；③無明顯斜視；④無眼部手術(shù)史或眼部外傷史；⑤無影響視力、屈光度改變的全身系統(tǒng)性疾??；⑥無長期用藥史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①屈光度＜-10.00 D；②患有斜視、弱視，圓錐角膜以及其他角膜擴張性疾??；③存在活動性眼部疾??；④患有影響視力的白內(nèi)障、青光眼、眼底疾病及視神經(jīng)病變等眼部疾病；⑤具有眼部手術(shù)史或眼部外傷史；⑥具有全身病史及藥物服用史。

1.2 眼科檢查

本研究納入對象進行的眼科檢查包括：裸眼視力、矯正視力、裂隙燈顯微鏡及眼底、散瞳驗光、眼壓等檢查。

1.3 SNP的選擇

本研究針對

RASGRF1

基因及其上游100 kb為候選區(qū)域，即chr15:79483215-79383215（hg19）。選取的候選位點考慮以下條件：①從千人基因組中國人群中挑選MAF＞10%的SNP位點（合計350個SNPs）。②從ENCODE數(shù)據(jù)庫（http://screen.encodeproject.org）獲取眼部相關(guān)的組織和細(xì)胞的順式調(diào)控元件ccRE數(shù)據(jù)，篩選

RASGRF1

及其上游100 kb范圍內(nèi)（chr15:79250289-79483215）的ccRE序列。③GTEx數(shù)據(jù)庫中與候選區(qū)域基因表達顯著相關(guān)的SNPs。最終本研究選擇了5個SNPs進行基因分型分析（見表1）。

1.4 血樣采集和DNA提取

選用QIAampDNA 全血抽提試劑盒（德國Qiagen公司）提取研究樣本的基因組DNA。

1.5 SNP基因的分型和測序

利用改進的多重連接酶檢測反應(yīng)技術(shù)（Ligase detection reaction,LDR）進行SNP分型（上海天昊生物科技有限公司）。所用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）引物和LDR探針見表2。純化后多重PCR產(chǎn)物用于LDR反應(yīng)，之后使用ABI3730XL測序儀(美國Applied Biosystems公司)進行檢測，使用GeneMapper軟件 (version 4.1,Applied Biosystems)進行分型數(shù)據(jù)分析。分型過程中確保陰性對照無條帶，此外10%的樣本被隨機挑選進行測序和重復(fù)實驗的驗證，確保檢測結(jié)果的可靠性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

系列病例對照研究。利用Plink1.9 軟件進行候選SNPs 與近視的相關(guān)性分析。使用卡方檢驗在對照樣本中進行哈-溫平衡（Hardy-Weinbergequilibrium,HWE）檢測和性別差異分析。本研究所有候選位點均符合哈-溫平衡（P＞0.05）。應(yīng)用

t

檢驗對年齡因素進行統(tǒng)計分析。不同遺傳模型下的比值比（Odds ratios,OR），95%置信區(qū)間（Confidence intervals,CI）和

P

值利用非條件Logistic回歸分析進行年齡和性別校正。以

P

＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

本研究共收集到258例（516眼）近視患者，其中高度近視組166例（332眼），其中男96例，女70例，SE為（-7.55±1.53）D；中低度近視組92例（184眼），其中男51例，女41例，SE（-1.00±0.48）D；正常對照組77 例（154 眼，男53 例，女24 例），SE（-0.16±0.30）D，各組的年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=0.43，

P

=0.56），SE比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

t

=38.73，

P

＜0.001）。

2.2 RASGRF1內(nèi)含子的rs8033417與高度近視顯著相關(guān)

本研究涉及的rs8033417、rs2870087、rs4778879、rs12902831、rs939658最小等位基因頻率與千人基因組中國人群（CHB和CHS）表現(xiàn)出相近的頻率（見表1），同時對照樣本符合哈-溫平衡檢測（

P

＞ 0.05）。本研究在對SNPs進行基因分型后，比較了不同SNP基因型在共顯性、顯性、隱性、超顯性、加性5 種遺傳模式下的分布差異，見表3。本研究發(fā)現(xiàn)rs2870087、rs4778879、rs12902831、rs939658位點在不同遺傳模式下，在近視組和對照組中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05），然而，在其他4種遺傳模式中，rs8033417基因型頻率在近視組和對照組中的分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（共顯性模式

P

=0.026，顯性

P

=0.007，隱性

P

=0.310。超顯性

P

=0.026，加性

P

=0.011），

P

值進行Bonferroni校正后，在顯性模式下此差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.034），而在加性模式下，

P

值邊緣顯著（

P

=0.055）。顯性模式下，與T/T基因型比較，C/T-C/C基因型能顯著降低近視的患病風(fēng)險（

OR

=0.49,95%

CI

:0.29～0.83,

P

=0.035）。

表1.RASGRF1基因的候選SNPs信息Table 1.The candidate SNPs information of RASGRF1 gene was selected

表2.RCR引物和LDR探針Table 2.RCR primer and LDR probe

表3.RASGRF1與近視的關(guān)聯(lián)分析Table 3.Association analysis of RASGRF1 and myopia

（續(xù)表）

本研究根據(jù)近視程度，分析候選SNPs與輕度近視和重度近視的相關(guān)性，未能發(fā)現(xiàn)候選SNP位點與輕度近視的任何相關(guān)性。在高度近視人群中，本研究發(fā)現(xiàn)rs8033417與高度近視的患病風(fēng)險明顯相關(guān)，見表4。在顯性模式下，與T/T基因型比較，C/T-C/C基因型能明顯降低近視的患病風(fēng)險（

OR

=0.48,95%

CI

:0.28～0.83,

P

=0.043）；在加性模式下，與等位基因T比較，等位基因C能降低高度近視的作用（

OR

=0.54,95%

CI

:0.34～0.84,

P

=0.043），但是這種相關(guān)性并不存在于其他候選SNPs中，見表5。

2.3 rs8033417 T/C的生物信息學(xué)分析和功能預(yù)測

rs8033417 位于

RASGRF1

的第23 內(nèi)含子和長非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）基因

RP11-16K12.1

（又稱為LOC100129540）的下游約400 bp處（見圖1）。根據(jù)ENCODE數(shù)據(jù)，rs8033417也位于候選順式調(diào)控元件EH37E0380686中，此順式調(diào)控元件具有H3K27ac表觀修飾，且位于非色素睫狀上皮細(xì)胞的DNase-I超敏感位點（見圖1），因此該調(diào)控元件具有典型的增強子特征。此外，本研究結(jié)合GTEx數(shù)據(jù)進一步分析rs8033417 與基因表達的關(guān)系。GTEx的表達數(shù)量性狀基因座（expression quantitative trait loci，eQTL）數(shù)據(jù)顯示，在人小腦組織中rs8033417與

lncRNA

基因

RP11-16K12.1

的表達具有顯著相關(guān)性。與rs8033417T/T和T/C基因型相比，rs8033417C/C基因型與

RP11-16K12.1

高水平的mRNA相關(guān)（

P

=4.63×10-6），但是這種相關(guān)性不存在于

RASGRF1

基因中（

P

=0.474） （見圖2）。

RP11-16K12.1

轉(zhuǎn)錄本長度有1.9kb（ENST00000316148.4），轉(zhuǎn)錄方向與

RASGRF1

方向相反，屬于反義lncRNA。結(jié)合關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，本研究推測rs8033417C/C很可能通過促進lncRNARP11-16K12.1的表達進而調(diào)控

RASGRF1

基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響甘肅人群近視的發(fā)生發(fā)展。

表4.rs8033417與高度近視和低度近視的關(guān)聯(lián)分析Table 4.Correlation analysis of rs8033417 with high myopia and low myopia

表5.其余4個SNPs與高度近視的關(guān)聯(lián)分析Table 5.Correlation analysis of other 4 SNPs with high myopia

（續(xù)表）

3 討論

RASGRF1

基因與視覺功能具有密切關(guān)系，是近視發(fā)生的易感基因。

RASGRF1

缺陷可導(dǎo)致小鼠的光感、視覺感覺過程受損和晶狀體異常。在豚鼠的近視模型中發(fā)現(xiàn)

RASGRF1

在鞏膜上表達顯著上調(diào)。本研究推測

RASGRF1

基因表達失調(diào)很可能是近視等視覺相關(guān)疾病發(fā)生的易感因素之一。為了尋找

RASGRF1

基因中與近視發(fā)生相關(guān)的具有功能性的SNPs，本研究針對

RASGRF1

候選調(diào)控元件序列中SNPs，在甘肅地區(qū)近視人群中通過病例對照研究，發(fā)現(xiàn)位于

RASGRF1

第23 內(nèi)含子的rs8033417T/C變異與近視發(fā)生顯著相關(guān)，與rs8033417T等位基因比較，C等位基因能顯著地降低高度近視（雙眼-10.00 D＜SE≤-6.00 D）的發(fā)生風(fēng)險（加性模型

P

=0.032,

OR

=0.54,95%

CI

=0.34～0.84）。本研究發(fā)現(xiàn)rs8033417 及其周圍序列具有基因增強子特征，進一步分析發(fā)現(xiàn)rs8033417T/C與

RASGRF1

的mRNA水平不相關(guān)，而與長鏈非編碼RNA基因RP11-16K12.1的表達相關(guān)。盡管這種相關(guān)性是基于GTEx中人小腦組織的eQTL數(shù)據(jù)，但是有文獻報道RASGRF1 在神經(jīng)元細(xì)胞和視網(wǎng)膜等眼組織細(xì)胞中均呈高水平表達，據(jù)此推斷rs8033417T/C與RP11-16K12.1表達的相關(guān)性也很可能存在于眼組織細(xì)胞中，從而影響近視的發(fā)生過程。然而，rs8033417T/C以及RP11-16K12.1與近視發(fā)生的相關(guān)性需要擴大樣本以及在不同種族進行進一步驗證。同時，需要通過體外和體內(nèi)實驗進一步研究RP11-16K12.1 是否能調(diào)控

RASGRF1

基因表達從而參與近視的發(fā)生發(fā)展過程。

圖1.rs8033417位于長非編碼RNA基因RP11-16K12.1的順式調(diào)控元件Figure 1.rs8033417 located in the cis-acting element of long non-coding RNA gene RP11-16K12.1.

圖2.rs8033417表達的相關(guān)性在人小腦組織的表達Figure 2.Correlation of rs8033417 expression in human cerebellum.

長鏈非編碼RNA長度一般大于 200 bp，可以通過介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用、誘導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)和核小體修飾、調(diào)控可變剪接模式、作為RNA“海綿”結(jié)合miRNA等方式參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、蛋白定位、細(xì)胞分化和細(xì)胞干性維持等各種細(xì)胞活動中。RP11-16K12.1轉(zhuǎn)錄長度為1.9 kb，位于

RASGRF1

基因的反義鏈，與

RASGRF1

轉(zhuǎn)錄方向相反，屬于反義長鏈非編碼RNA。甲狀腺癌中發(fā)現(xiàn)RP11-16K12.1表達增高，其靶基因是

RASGRF1

基因，目前尚未有RP11-16K12.1 功能相關(guān)的研究報道。長鏈非編碼RNA與眼組織細(xì)胞發(fā)育、功能維持及眼部常見疾病密切相關(guān)。已有多項研究報道RNCR2、Six3OS、Vax2os1及TUG1等長鏈非編碼RNA參與眼的發(fā)育和功能維持，它們是視網(wǎng)膜細(xì)胞分化、增值、凋亡的重要調(diào)控因子，并直接影響光感受器細(xì)胞的形成和視網(wǎng)膜的功能。常見眼部疾病的發(fā)生過程中長鏈非編碼RNA也扮演著重要作用，如MIAT（Myocardial infarction-associated transcript）基因調(diào)控視網(wǎng)膜細(xì)胞的生長分化，它的表達上調(diào)與糖尿病眼病患者的視網(wǎng)膜病變發(fā)生密切相關(guān)；GWAS研究發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1 與開角型青光眼和青光眼的視神經(jīng)變性顯著相關(guān)。鑒于

RASGRF1

與近視發(fā)生的密切相關(guān)性，進一步研究RP11-16K12.1 在體內(nèi)的表達模式以及調(diào)控

RASGRF1

基因的分子機制，對于近視發(fā)生的分子機制具有重要作用。本研究在甘肅近視人群中，針對RASGRF1基因順式調(diào)控元件遺傳變異進行病例對照研究，發(fā)現(xiàn)一個位于

RASGRF1

基因反義長非編碼RNA附近的rs8033417T/C能顯著降低高度近視的發(fā)生風(fēng)險。通過分析公共表觀遺傳數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)rs8033417T/C所在區(qū)域具有增強子特征，并能顯著增強RP11-16K12.1的表達。本研究結(jié)果為后續(xù)

RASGRF1

表達調(diào)控方式提供新的研究思路，有助于揭示近視發(fā)生的分子機制。

利益沖突申明

本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明

汪向利：參與課題選題、設(shè)計，數(shù)據(jù)分析及論文撰寫。楊麗媛、金庸、李培強、丁韻涵：參與課題實施，收集數(shù)據(jù)及統(tǒng)計學(xué)分析。謝小冬：參與選題、設(shè)計及論文修改。楊君：參與課題選題、設(shè)計和論文修改并根據(jù)編輯部的意見進行核修