HPLC法測定不同煎煮時間疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷的含量

龍小妹 張艷嬌 黃寬 林艾和 李蓉 夏宗霄 范源

摘要：目的 測定不同煎煮時間疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷的含量變化。方法 按方藥的組成稱取制備好的疏調(diào)氣機(jī)湯散12.4 g置于燒杯中，加純凈水在電磁爐上煎煮至沸騰，保持微沸時間依次為5、15、25、35、45 min，共煎煮兩次，過濾、濃縮、甲醇溶解、超聲、定容，微孔濾膜過濾，采用高效液相色譜法測定芍藥苷和淫羊藿苷的含量。結(jié)果 芍藥苷和淫羊藿苷分別在2.744～16.464 μg（R2=0.9992），0.504～3.024 μg（R2=0.9993）的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷均在煎煮15 min時含量最高。結(jié)論 疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷在不同煎煮時間下含量不同，本研究可為該方的最佳煎煮時間、臨床指導(dǎo)用藥和質(zhì)量控制等提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：疏調(diào)氣機(jī)湯;芍藥苷;淫羊藿苷

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2022）04-0060-05

Determination of Paeoniflorin and Icariin in Shutiaoqiji Decoctionwith Different Decoction Time by HPLC

LONG Xiao-mei1， ZHANG Yan-jiao1， HUANG Kuan1， LIN Ai-he1， LI Rong1， XIA Zong-xiao1， FAN Yuan1，2

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. The Second Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650216， China）

【Abstract】Objective： To determine the content changes of paeoniflorin and icariin in Shutiaoqiji Decoction with different decoction time. Methods： 12.4g of the prepared Shutiaojijitang powder was weighed according to the composition of the prescription and put in a beaker and pure water was added into the beaker and cooked on the induction cooker until it boiled， keeping the micro-boiling time as 5， 15， 25， 35 and 45 min， decocting twice in total and then filtered， concentrated， dissolved in methanol， sonicated， constant volume， filtered through a microporous membrane. The contents of paeoniflorin and icariin were determined by HPLC. Results： Paeoniflorin and icariin showed a good linear relationship in the range of 2.744 to 16.464 μg （R2=0.9992） and 0.504-3.024 μg （R2=0.9993）， respectively. The contents of paeoniflorin and icariin in Shutiaoqiji Decoction were the highest when decocted for 15 min. Conclusion： The contents of paeoniflorin and icariin in Shutiaoqiji Decoction are different under different decoction time. This study can provide some reference for the optimal decoction time， clinical guidance medication and quality control of the prescription.

【Key words】Shutiaoqiji Decoction; Paeoniflorin; Icariin

疏調(diào)氣機(jī)湯是國醫(yī)大師張震張老先生在臨床七十余年根據(jù)疏調(diào)氣機(jī)的思想上總結(jié)出來的經(jīng)驗方，其以四逆散為基礎(chǔ)方，該方臨床治療效果顯著且應(yīng)用廣泛。由君藥（柴胡）、臣藥（仙靈脾、白術(shù)、郁金、香附）、佐藥（川芎、丹參、白芍、枳殼、茯苓）、使藥（甘草、薄荷）組成[1]，該方具有疏肝理氣、補(bǔ)益脾腎、調(diào)暢氣機(jī)、活血行血之功能，主治肝失疏泄、脾腎不足、氣機(jī)失常、血行不暢等證。張芳等[2]的臨床研究表明，疏調(diào)氣機(jī)湯可以調(diào)節(jié)甲狀腺機(jī)能和治療肝郁脾虛型橋本氏甲狀腺炎合并甲狀腺功能減退，緩解病人的情緒、改善失眠等癥狀。有報道指出[3]疏調(diào)氣機(jī)湯還可以治療鼓脹（胃間質(zhì)瘤）。

身為“浙八味”之一的中藥白芍屬于毛茛科植物，為補(bǔ)血藥，其主要成分芍藥苷為單帖類糖苷化合物，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易于水解和揮發(fā)，因此在提取過程中應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行[4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，芍藥苷有抗骨質(zhì)疏松、促血管生成、抗抑郁、抗炎、鎮(zhèn)痛、防治糖尿病并發(fā)癥、抗腫瘤等多種作用[5-7]。

仙靈脾即淫羊藿，屬于小檗科植物，為補(bǔ)陽藥，其主要成分淫羊藿苷為黃酮類化合物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷具有抗骨質(zhì)疏松[8]、抗炎、抗癌、抗衰老、促進(jìn)生殖系統(tǒng)等多種作用[9]。

疏調(diào)氣機(jī)湯的核心是白芍、仙靈脾、柴胡、茯苓和白術(shù)這五者之間的配伍[10]，其中作為臣藥的仙靈脾和使藥的白芍在該方中所用劑量較高，因此疏調(diào)氣機(jī)湯臨床療效的突出與白芍和仙靈脾具有一定的關(guān)聯(lián)。湯劑的臨床療效與煎煮時間密切相關(guān)，若煎煮時間不夠，有效成分未能完全溶出;若煎煮時間過長，則有效成分易受熱分解或揮發(fā)，從而影響湯劑的整體治療效果。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)有疏調(diào)氣機(jī)湯中化實驗的文章，因此本實驗通過測定不同煎煮時間疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷的含量，為該方的最佳煎煮時間、臨床指導(dǎo)用藥和質(zhì)量控制等提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 本實驗所用儀器見表1。

1.2 試藥 柴胡、郁金、仙靈脾、丹參、川芎、枳殼、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷、甘草均購于云南中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院藥房;香附購于云南巧絲（聲貝）科技有限公司（批號：20072418）;芍藥苷對照品購于四川省維克奇生物科技有限公司（批號：wkq20041008，HPLC ≥ 98%）;淫羊藿苷對照品購于四川省維克奇生物科技有限公司（批號：wkq20042802，HPLC ≥ 98%）。

1.3 試劑 本實驗所用試劑見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈（C）-0.1%磷酸（D）梯度洗脫（梯度洗脫程序見表3）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：270 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷6.86 mg，置于5 mL的容量瓶中，加甲醇（分析純）定容成1.372 mg/mL的溶液，備用。精密稱取淫羊藿苷2.52 mg，置于10 mL的容量瓶中，加甲醇（分析純）定容，即得0.252 mg/mL的淫羊藿苷溶液，備用。

2.2.2 疏調(diào)氣機(jī)湯散的制備 按照疏調(diào)氣機(jī)湯的方藥組成：柴胡10 g，丹參10 g，香附10 g，郁金10 g，白芍12 g，仙靈脾15 g，川芎10 g，茯苓15 g，枳殼10 g，白術(shù)10 g，甘草6 g，薄荷6 g，分別稱取藥材，隨后經(jīng)高速萬能粉碎機(jī)打粉，即得疏調(diào)氣機(jī)湯散，備用。

2.2.3 疏調(diào)氣機(jī)湯水煎液的制備 取疏調(diào)氣機(jī)湯散5份，每份12.4 g，分成5組，分別標(biāo)記為5、15、25、35、45 min。上述5組藥材分別置于燒杯中，加149 mL純凈水，料液比為1∶12，浸泡20 min[11]。浸泡完成后，將燒杯放置于墊有石棉網(wǎng)的電磁爐上（功率400W，溫度80 ℃）加熱，待藥品沸騰后，繼續(xù)保持相同功率和溫度持續(xù)微沸狀態(tài)，在此期間，并用玻璃棒時不時地攪拌，微沸時間依次為5、15、25、35、45 min。待煎煮時間完畢后，趁熱過濾。共煎2次，合并提取液，即得五組不同煎煮時間的疏調(diào)氣機(jī)湯水煎液。

2.2.4 疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液的制備 將疏調(diào)氣機(jī)湯水煎液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓回收溶液至干（溫度為60 ℃[12]），加甲醇（分析純）溶解殘渣，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，超聲30 min（溫度為49.33 ℃），過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇（分析純）定容，即得疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 分別取“2.2.1”項下的芍藥苷和淫羊藿苷對照品溶液，0.45 μm微孔薄膜過濾后，依次精密吸取 2、4、6、8、10、12 μL，按“3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，得芍藥苷的回歸方程為Y=75.709X+197.31，R2=0.9992;淫羊藿苷的回歸方程為Y=1983.2X+32.9，R2=0.9993。結(jié)果表明芍藥苷在2.744～16.464 μg，淫羊藿苷在0.504～3.024 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取煎煮時間為15 min的疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液，室溫放置0、2、4、6、8、10 h，0.45 μm微孔薄膜過濾，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行測定，通過計算得出芍藥苷峰面積的RSD值為 1.40 %（n=6）、淫羊藿苷峰面積的RSD值為1.58 %（n=6），結(jié)果表明疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度實驗 取“2.2.1”項下的芍藥苷和淫羊藿苷對照品溶液各0.3 mL混合，0.45 μm微孔薄膜過濾，按照“2.1”項下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算得芍藥苷、淫羊藿苷峰面積的RSD值分別為1.26%（n=6）、0.92%（n=6），結(jié)果表明本實驗所用儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 取“2.2.3”項下的方法制備一份15 min的疏調(diào)氣機(jī)湯水煎液（記錄總體積），用移液管精密移取5份，每份40 mL。按照“2.2.4”項下方法制備各疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液，0.45 μm微孔薄膜過濾，按照“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行測定，記錄色譜峰的峰面積，計算得出芍藥苷、淫羊藿苷的峰面積RSD值分別為2.77%（n=5）、1.14%（n=5），結(jié)果表明疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率實驗 精密量取已知芍藥苷含量為5.59 mg/g，淫羊藿苷含量為1.02 mg/g的疏調(diào)氣機(jī)湯散各6份，每份加入相同含量的芍藥苷和淫羊藿苷對照品溶液適量，按“2.2.3”項下方法制備疏調(diào)氣機(jī)湯水煎液，再按“3.2.4”制備各供試品溶液，按“2.1” 項下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

2.8 含量測定 按照“2.2.3”項下方法制得五個不同煎煮時間段的疏調(diào)氣機(jī)湯水煎液，再按照“2.2.4”項下方法制得各疏調(diào)氣機(jī)湯供試品溶液，用0.45 μm微孔薄膜過濾，在“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣進(jìn)行測定，計算疏調(diào)氣機(jī)湯在不同煎煮時間條件下芍藥苷和淫羊藿苷的含有量，結(jié)果見表5。

2.9 不同煎煮時間下含量變化 疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷的含量受煎煮時間影響較大，其含量變化趨勢為：芍藥苷的含量在5～15 min內(nèi)顯著增加，15 min達(dá)最高峰，在15～45 min內(nèi)顯著下降，其中15～35 min與35～45 min內(nèi)的變化比較，15～35 min下降稍緩和，35～45 min下降較迅速;淫羊藿苷的含量在5～15 min內(nèi)對于芍藥苷此時間段的增加稍緩和，15 min達(dá)最高峰，在15～45 min內(nèi)顯著下降，其中15～25 min內(nèi)下降最快，且芍藥苷的含量明顯比淫羊藿苷高，結(jié)果見圖2。

3 討論

本實驗測定了不同煎煮時間疏調(diào)氣機(jī)湯中芍藥苷和淫羊藿苷的含量，結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)，這兩種成分的含量均在煎煮15 min時最高，且芍藥苷的含量明顯比淫羊藿苷高，在15 min后隨著煎煮時間的延長，兩者都呈現(xiàn)下降趨勢，因此根據(jù)本實驗所得結(jié)論，建議疏調(diào)氣機(jī)湯在煎煮用藥時，可煎煮15 min。本實驗結(jié)果具有一定的可信性，為疏調(diào)氣機(jī)湯的最佳煎煮時間、臨床指導(dǎo)用藥和質(zhì)量控制等提供一定的參考。

導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是：在煎煮5 min時，由于煎煮時間太短，導(dǎo)致其成分溶出不完全;在煎煮15 min后，由于芍藥苷為單萜類化合物，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，所以在此時間點之后隨著煎煮時間的延長，芍藥苷可能揮發(fā)或者發(fā)生水解，導(dǎo)致含量減少。淫羊藿苷為黃酮類化合物，化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，只在強(qiáng)酸強(qiáng)堿的情況下結(jié)構(gòu)式才容易發(fā)生改變[13]，通過陳彥等[14]的實驗得出，隨著煎煮時間的延長和溫度的升高，淫羊藿苷的含量均隨之增加，而本實驗在提取樣品和處理樣品中都只考慮芍藥苷的不穩(wěn)定性而采取較低溫度進(jìn)行，可能導(dǎo)致淫羊藿苷溶出較少。在實驗過程中，因為是采用電磁爐加熱，樣品中所加的水分會隨著煎煮時間的延長而蒸發(fā)，從而導(dǎo)致煎煮液減少，故對實驗結(jié)果有一定的影響。

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（收稿日期：2021-10-12）