混合斑中精子細(xì)胞DNA 的自動(dòng)化批量提取*

柯永慶 袁 紅 湯志成 石尖

（東莞市公安局刑警支隊(duì)，廣東 東莞523008）

在法醫(yī)DNA 檢驗(yàn)工作中，混合斑中精子細(xì)胞的分離一直是DNA 檢驗(yàn)工作中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的方法主要有差異裂解法、濾膜法、細(xì)胞分選法、免疫磁珠法［1］等，這些方法均需要手工進(jìn)行處理，分型成功率很大程度受檢驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)、水平等主觀因素影響，且耗時(shí)較長(zhǎng)，需要實(shí)驗(yàn)人員全程跟蹤進(jìn)行操作，難以實(shí)現(xiàn)批量化的提取純化。隨著全自動(dòng)核酸提取工作站的投入使用，利用工作站實(shí)現(xiàn)對(duì)混合斑中精子細(xì)胞DNA 的全自動(dòng)化批量提取，將有助于提高工作效率。

1 材料與方法

1.1 樣本

日常受理的案件中，各類(lèi)疑似混合斑檢材241 份，依據(jù) 《GA/T766-2020 人精液 PSA 檢測(cè)金標(biāo)試劑條法》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果為陽(yáng)性（含弱陽(yáng)性）88例、結(jié)果為陰性153例，如表1所示。

表1 檢材類(lèi)型和數(shù)量

1.2 主要儀器和試劑

X-Pure 96 Plus 硅磁一體微量DNA 提取定量工作站（廣州高盛）、混合精斑DNA 磁珠純化試劑盒（8/16/24 人份，廣州高盛）、Power?Plex?18 System 擴(kuò)增試劑盒 （Promega 公司，美國(guó)）、ABI Veriti 型擴(kuò)增儀（AB 公司，美國(guó)）、ABI 3500XL 型全自動(dòng)熒光分析儀（AB 公司，美國(guó)）。

1.3 精子細(xì)胞DNA的分離提取

剪取適量檢材放入“混合精斑DNA 磁珠純化試劑盒”中專(zhuān)用裂解板的相應(yīng)孔位，每孔加入TNE 溶液450uL，插入人精液PSA 檢測(cè)金標(biāo)試劑條，待獲得結(jié)果后將試劑條丟棄，隨后每孔手工加入SDS 溶液40uL、PK 溶液40uL。將該裝有檢材和試劑的專(zhuān)用裂解板以及“混合精斑DNA 磁珠純化試劑盒”中的其他相關(guān)耗材放入“X-Pure 96 Plus 硅磁一體微量DNA 提取定量工作站”相應(yīng)指定位置，啟動(dòng)工作站，設(shè)定洗脫體系為50uL，自動(dòng)運(yùn)行3.5h 獲得精子細(xì)胞DNA模板和女性成分DNA模板。

1.4 STR復(fù)合擴(kuò)增及分析

使 用 PowerPlex?18D System 試 劑 盒 在 ABI Veriti 型擴(kuò)增儀（AB 公司，美國(guó)）上擴(kuò)增。反應(yīng)總體系10uL，其中DNA 模板2uL、Primer Pair Mix 2uL、Master Mix 2uL、純水4uL。擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為28 次，用3500XL 分析儀（AB 公司，美國(guó)）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，使用GeneMarker Forensic V1.9 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《人類(lèi)DNA 熒光標(biāo)記STR 分型結(jié)果的分型及應(yīng)用》（GA/T 1163-2014）相關(guān)要求，峰高大于100 相對(duì)熒光單位，檢出17 個(gè)以上STR 基因座和Amelogenin 基因座標(biāo)記為檢出，檢驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。

表2 PSA為陽(yáng)性(含弱陽(yáng)性)檢材檢驗(yàn)結(jié)果

表3 PSA為陰性檢材檢驗(yàn)結(jié)果

從表2可看出，88例PSA 為陽(yáng)性(含弱陽(yáng)性)的檢材中，檢出單一男性分型有56 例，約占63.6%；檢出混合分型有23例，約占26.1%；未檢出分型的有9 例，約占10.2%。其中，對(duì)23例檢出混合分型的檢材采取手工提取純化，21例仍檢出混合分型，約占91.3%；1 例未檢出分型，約占4.3%；1 例檢出單一男性分型，約占4.3%。對(duì)9 例未檢出分型的檢材采取手工提取純化，8 例仍未檢出分型，約占88.9%；1 例檢出分型，約占11.1%。

從表3 可看出，153 例PSA 為陰性的檢材中，檢出單一男性分型有16 例，約占10.5%；檢出混合分型有8 例，約占5.2%；未檢出分型有129 例，約占84.3%。其中，對(duì)8 例檢出混合分型的檢材采取手工提取純化，7 例檢出仍檢出混合分型，占87.5%；1 例檢出單一分型，占12.5%。未對(duì)129 例未檢出分型的樣本進(jìn)行再次檢驗(yàn)。

2.2 討論

2.2.1 方法的選擇

混合精斑的提取純化，目前實(shí)驗(yàn)室主要采用的方法主要有差異裂解法、濾膜法、免疫磁珠法、細(xì)胞分選法等，其各自的優(yōu)缺點(diǎn)如表4所示，因成本等客觀問(wèn)題，免疫磁珠法、細(xì)胞分選法較少運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

表4 常見(jiàn)提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)

差異裂解法作為提取實(shí)驗(yàn)室常用方法，有著成本低廉的優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)條件較好的混合斑檢材能夠有效去除女性成分，獲得男性的準(zhǔn)確分型。但對(duì)于微量、陳舊或精子相對(duì)含量較少的檢材，可能因消化不完全或者過(guò)度消化，導(dǎo)致精子DNA 損失。精子細(xì)胞一般頭部長(zhǎng)3.0～5.0μm、寬2.0～3.0μm、厚1～2μm，尾部長(zhǎng)40～60μm［2］。利用孔徑為1μm的硝酸纖維素膜，根據(jù)分子篩原理，當(dāng)消化后的混合液體流經(jīng)內(nèi)管后，未被消化的精子細(xì)胞經(jīng)過(guò)濾被攔截在尼龍膜內(nèi)，女性上皮細(xì)胞DNA 成分溶液穿過(guò)尼龍膜進(jìn)入外套管內(nèi)，從而達(dá)到物理分離精子細(xì)胞的目的。

精子細(xì)胞膜富含硫醇蛋白，需在二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巰基乙醇等還原劑的作用下才能打開(kāi)其中的二硫鍵，從而破膜釋放DNA。結(jié)合差異裂解法和濾膜法特點(diǎn)，采取“多重裂解濾膜的方法”（見(jiàn)圖1）。利用獨(dú)特配方的裂解液（能徹底消化精子外細(xì)胞且不損傷精子細(xì)胞）將混合斑中的精子團(tuán)裂解分離成單精子細(xì)胞，采用特殊孔徑濾膜，可以有效截留精子，去除非目標(biāo)殘余DNA 的干擾，從而提高精子回收率，并避免了消化不完全或者過(guò)度消化導(dǎo)致的精子DNA損失。

圖1 多重裂解濾膜法

女性陰道分泌物成分復(fù)雜，往往混有大量女性白帶物質(zhì)和腸道細(xì)菌等，其中有些成分是擴(kuò)增抑制物，利用磁珠不吸附除DNA 外的其他雜質(zhì)，既實(shí)現(xiàn)對(duì)精斑DNA 的半定量，又去除了PCR 抑制物的干擾作用，從而獲得DNA 的優(yōu)化分型［3］。

綜上所述，利用混合精斑全自動(dòng)提取試劑盒（8/16/24 人份）在X-Pure 96 Plus 硅磁一體微量DNA 提取定量工作站可實(shí)現(xiàn)批量化全自動(dòng)提取，基本實(shí)現(xiàn)無(wú)需進(jìn)行手工操作和人工干預(yù)跟蹤，實(shí)驗(yàn)效果與手工提取大致相同，極大地提高了工作效率。

2.2.2 存在不足及改進(jìn)方向

從圖1 可直觀看出，多重裂解濾膜法在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，檢材載體一直沒(méi)有去除，最終與截留的精子細(xì)胞一同進(jìn)行裂解，該做法可保證精子細(xì)胞不會(huì)丟失，提高了男性DNA 的檢出率，但由于沒(méi)有丟棄檢材載體，導(dǎo)致檢材載體上的女性成分消化不完全，導(dǎo)致檢出混合分型的概率大大提高。實(shí)驗(yàn)表明，混合斑中男女比例達(dá)到1∶100 時(shí)，即使是經(jīng)過(guò)改進(jìn)的裂解法，其成功率也只有20%［4］。從表2 中可以看出：采取多重裂解濾膜方法，PSA 為陽(yáng)性（含弱陽(yáng)性）的檢材檢出男女混合的概率為26%。下一步實(shí)驗(yàn)需要注意以下幾點(diǎn)，一是通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中丟棄已分離精子細(xì)胞的檢材載體，從而提高檢出單一的概率；二是通過(guò)優(yōu)化試劑，使試劑更溫和有效，實(shí)現(xiàn)完全消化女性成分的同時(shí)不會(huì)導(dǎo)致精子細(xì)胞DNA 的丟失；三是通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)?zāi)K，實(shí)現(xiàn)由全自動(dòng)工作站進(jìn)行PSA 確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步提高工作效率。