EZH2抑制劑對膀胱癌T24細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制研究*

陳翔，何天基，冉俊武，王偉，姚遠(yuǎn)，周毅，石海林

（柳州市人民醫(yī)院泌尿外科，廣西柳州 545000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)病率居男性惡性腫瘤前列，且發(fā)病率和病死率逐年升高[1]。膀胱癌細(xì)胞主要為尿路上皮細(xì)胞，有研究顯示，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮來源惡性腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的主要原因之一，與病情進(jìn)展關(guān)系密切[2]。Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）是多梳蛋白抑制復(fù)合物家族成員之一，可催化組蛋白H3 的甲基化過程，參與調(diào)控多種靶基因沉默。有研究顯示，EZH2 與膀胱癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。GSK126 是一種新型的EZH2 抑制劑，可抑制腫瘤細(xì)胞中EZH2 高表達(dá)狀態(tài)。目前，關(guān)于GSK126 對膀胱癌細(xì)胞EMT 過程的調(diào)控報(bào)道較少，本研究旨在探究其對膀胱癌T24 細(xì)胞EMT 過程的影響及可能機(jī)制，為膀胱癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人膀胱癌細(xì)胞系T24 購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，置于含100 u/mL 青霉素、100 mg/L 青霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，在37℃、5%二氧化碳及飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

EZH2 抑制劑GSK126、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）（美國Sigma 公司），Matrigel 基質(zhì)膠（美國Corning 公司），RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司），實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒（美國Thermo Fisher 公司），兔抗人EZH2、β-catenin 單抗、小鼠抗人Ecadherin、Vimentin、非受體型酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、磷酸化JAK2（p-JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）、磷酸化STAT3（p-STAT3）單抗（美國Abcam 公司），辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標(biāo)記的IgG 相應(yīng)二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

Transwell 小室（美國Corning Incorporated 公司），7300 qRT-PCR 儀（美國ABI 公司），電泳儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥物配置將GSK126 溶于DMSO 中獲得濃度為2 000 μmol/L 的母液，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用RPMI 1640 培養(yǎng)基稀釋至終濃度為10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 的GSK126 溶液。

1.3.2 分組及干預(yù)方法取對數(shù)生長期的T24 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×105個(gè)/mL，重新接種于96 孔板，隨機(jī)分為空白組、GSK126 低劑量組、GSK126 中劑量組、GSK126 高劑量組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，貼壁生長后，吸去培養(yǎng)基，分別用終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L 的GSK126細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力取4組干預(yù)24 h、48 h、72 h 的T24 細(xì)胞，每孔加入5 g/L 新鮮制備的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，充分混勻溶解結(jié)晶，用酶標(biāo)儀檢測290 nm 波長處的吸光度（Absorbance, A）值，A 值越大代表細(xì)胞密度越高，增殖能力越強(qiáng)。

1.3.4 Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力取4 組干預(yù)24 h 的T24 細(xì)胞，胰蛋白酶消化，RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)/mL 備用。RPMI 1640 培養(yǎng)基與Matrigel 基質(zhì)膠按1∶6 稀釋，包被Transwell 小室濾膜，置于24 孔板，上層加入各組細(xì)胞懸液2.0×105個(gè)/mL，下層加入含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，無菌棉簽擦除濾膜上層細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，隨機(jī)取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)[5]。

1.3.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力取4 組T24 細(xì)胞接種至24 孔板，待細(xì)胞融合為單層細(xì)胞后，用無菌槍頭在培養(yǎng)板上劃直線，培養(yǎng)液沖洗劃痕使其邊緣整齊，拍照測量初始劃痕寬度，各組加入相應(yīng)濃度含藥培養(yǎng)基后同條件繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再次拍照測量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，細(xì)胞遷移率%=[（初始劃痕寬度-48 h 劃痕寬度）/初始劃痕寬度]×100%。

1.3.6 qRT-PCR檢測EZH2、E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA 的表達(dá)收集各組GSK126 干預(yù)48 h 細(xì)胞，采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，酶標(biāo)儀測定RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。按照試劑盒說明書設(shè)定20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 10.5 μL，10 μmol/L正反向引物各1.0 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，28℃退火45 s，72℃延伸60 s，共38 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參對照，用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 檢測EZH2、EMT 和JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)收集各組GSK126干預(yù)48 h 細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管，加入500 μL 細(xì)胞裂解液，冰上裂解25 min，12 000 r/min 離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液沸水水浴10 min，BCA 法測定總蛋白，取50 μg 蛋白進(jìn)行恒定電流的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)分離膠至硝酸纖維素膜，加入封閉液室溫封閉2 h，加入EZH2（1∶200）、E-cadherin（1∶200）、Vimentin（1∶400）、βcatenin（1∶200）、p-JAK2（1∶400）、JAK2（1∶400）、p-STAT3（1∶200）、STAT3 一抗（1∶200），4℃過夜，TBST充分洗滌，加入1∶2 000 稀釋相應(yīng)二抗，室溫孵育4 h，TBST 再次洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯影。采用Image J 圖像分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值的比值，即為該蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較

空白組及GSK126 低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 的增殖能力比較，采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間細(xì)胞增殖能力有差異（F=15.498，P=0.000）；②4 組細(xì)胞增殖能力有差異（F=5.162，P =0.013）；③4 組細(xì)胞增殖能力變化趨勢有差異（F=12.314，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)24 h，GSK126 中、高劑量組細(xì)胞增殖能力低于空白組（P＜0.05），且GSK126 高劑量組低于GSK126 中劑量組（P＜0.05）；細(xì)胞培養(yǎng)48 h 和72 h，GSK126 低、中、高劑量組細(xì)胞增殖能力低于空白組（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而降低（P＜0.05）；隨著時(shí)間延長，各組細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞增殖能力比較 （±s）

表2 各組細(xì)胞增殖能力比較 （±s）

注：①與24 h比較，P ＜0.05；②與48 h比較，P ＜0.05；③與空白組比較，P ＜0.05；④與GSK126低劑量組比較，P ＜0.05；⑤與GSK126中劑量組比較，P ＜0.05。

72 h 0.950±0.072①②0.701±0.067①②③0.621±0.060①②③④0.422±0.056①②③④⑤組別空白組GSK126低劑量組GSK126中劑量組GSK126高劑量組24 h 0.314±0.041 0.301±0.038 0.294±0.042③0.280±0.035③④48 h 0.571±0.062①0.511±0.060①③0.494±0.054①③④0.350±0.052①③④⑤

2.2 各組細(xì)胞侵襲和遷移能力比較

空白組及GSK126 低、中、高劑量組穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.685 和52.3001，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移率均降低（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移率比較 （±s）

表3 各組穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移率比較 （±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與GSK126低劑量組比較，P ＜0.05；③與GSK126中劑量組比較，P ＜0.05。

遷移率/%85.49±9.20 62.31±9.11①43.20±8.54①②36.87.±6.21①②③52.301 0.000組別空白組GSK126低劑量組GSK126中劑量組GSK126高劑量組F 值P 值穿膜細(xì)胞數(shù)/（個(gè)/HP）120.40±11.37 94.20±10.26①53.80±10.20①②31.60±9.51①②③79.685 0.000

2.3 各組EZH2、E-cadherin、Vimentin、β -catenin mRNA相對表達(dá)量比較

空白組及GSK126 低、中、高劑量組EZH2、Ecadherin、Vimentin、β-catenin mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=198.091、95.147、85.140 和60.217，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組EZH2、Vimentin、β-catenin mRNA 相對表達(dá)量均降低（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而降低（P＜0.05）；與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組E-cadherin mRNA 相對表達(dá)量均升高（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而升高（P＜0.05）。見表4。

表4 各組EZH2、E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

表4 各組EZH2、E-cadherin、Vimentin、β-catenin mRNA相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與GSK126低劑量組比較，P ＜0.05；③與GSK126中劑量組比較，P ＜0.05。

組別空白組GSK126低劑量組GSK126中劑量組GSK126高劑量組F 值P 值β-catenin 1.89±0.13 1.56±0.12①1.12±0.10①②0.91±0.11①②③60.217 0.000 EZH2 2.05±0.13 1.64±0.10①1.02±0.11①②0.53±0.08①②③198.091 0.000 Vimentin 1.05±0.07 0.84±0.07①0.62±0.06①②0.35±0.05①②③95.147 0.000 E-cadherin 0.78±0.08 0.91±0.09①1.20±0.11①②1.54±0.10①②③85.140 0.000

2.4 各組EZH2、EMT相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

空白組及GSK126 低、中、高劑量組EZH2、Ecadherin、Vimentin、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=532.016、107.842、253.016 和305.871，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組EZH2、Vimentin、β-catenin 蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而降低（P＜0.05）；與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組Ecadherin 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而升高（P＜0.05）。見表5和圖1。

圖1 各組EZH2、EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)

表5 各組EZH2、EMT相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表5 各組EZH2、EMT相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與GSK126低劑量組比較，P ＜0.05；③與GSK126中劑量組比較，P ＜0.05。

組別空白組GSK126低劑量組GSK126中劑量組GSK126高劑量組F 值P 值β-catenin 1.21±0.10 0.91±0.07①0.70±0.08①②0.34±0.05①②③305.871 0.000 EZH2 0.85±0.07 0.42±0.040.95±0.08 0.16±0.04①②0.62±0.07①②0.07±0.02①②③0.37±0.06①②③532.006107.842 0.0000.000①Vinentin 1.87±0.12①E-cadherin 0.15±0.04 0.26±0.05①0.42±0.06①②0.79±0.07①②③253.016 0.000

2.5 各組JAK2/STAT3 信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

空白組及GSK126 低、中、高劑量組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=159.007 和217.835，均P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量均降低（P＜0.05），且隨GSK126 劑量升高而降低（P＜0.05）。見表6和圖2。

圖2 各組JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表6 各組JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

表6 各組JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較 （±s）

注：①與空白組比較，P ＜0.05；②與GSK126低劑量組比較，P ＜0.05；③與GSK126中劑量組比較，P ＜0.05。

p-STAT3/STAT3 0.91±0.12 0.75±0.08①0.46±0.07①②0.22±0.05①②③217.835 0.000組別空白組GSK126低劑量組GSK126中劑量組GSK126高劑量組F 值P 值p-JAK2/JAK2 0.95±0.07 0.61±0.05①0.43±0.04①②0.15±0.03①②③159.007 0.000

3 討論

近年來，隨著鉑類化療藥物的普及、分子靶向藥物的應(yīng)用，膀胱癌患者總體生存率得到顯著提高，精準(zhǔn)靶向治療成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[6-7]。但臨床調(diào)查結(jié)果顯示，膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高，術(shù)后12 個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)率為10%～60%，預(yù)后生存期短[8]。膀胱癌屬于尿路上皮細(xì)胞癌，病死率高。病灶轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是導(dǎo)致膀胱癌患者死亡的重要原因。近年來研究顯示，膀胱癌EMT 過程是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，膀胱上皮細(xì)胞在內(nèi)外因素誘導(dǎo)下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，該過程中細(xì)胞間黏附作用降低，癌細(xì)胞向遠(yuǎn)端侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，最終導(dǎo)致病灶復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[9]。表觀遺傳在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，EZH2基因是調(diào)控表觀遺傳的主要因子之一，參與組蛋白甲基化、EMT 等過程[10-11]。因此，抑制EZH2基因表達(dá)能抑制膀胱癌EMT 過程，從而為膀胱癌的治療提供新的研究方向。

EZH2基因定位于人7 號染色體，編碼746 個(gè)氨基酸，與果蠅E（z）蛋白的同源性為60.5%[12]。EZH2參與調(diào)控多種惡性腫瘤的進(jìn)展。既往研究顯示，EZH2 在結(jié)直腸正常黏膜組織、良性病變及腺癌中的陽性表達(dá)率依次升高，說明EZH2 參與結(jié)直腸癌變過程[13]。另有研究表明，EZH2 在肌層浸潤性膀胱癌患者病灶中高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，提示EZH2 可能參與膀胱癌EMT 過程，但仍需證據(jù)支持[14]。本研究首先通過檢測EZH2 抑制劑GSK126 對膀胱癌活性的影響，結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)24 h，GSK126 中、高劑量組細(xì)胞增殖能力均低于空白組；與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h 的細(xì)胞增殖能力及培養(yǎng)24 h 的穿膜細(xì)胞數(shù)、遷移率均降低，且具有劑量依賴性，提示抑制EZH2 可有效抑制T24 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，EZH2 與膀胱癌細(xì)胞活性密切相關(guān)。此外，本研究通過檢測EMT 相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GSK126 各劑量組Vimentin、β-catenin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量均低于空白組，E-cadherin mRNA 和蛋白相對表達(dá)量高于空白組，且均具有劑量依賴性，進(jìn)一步證實(shí)抑制EZH2 可能抑制T24 細(xì)胞EMT 過程。Vimentin 屬于細(xì)胞骨架蛋白，廣泛分布于內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞，是細(xì)胞EMT 的重要因子。有研究證實(shí)，Vimentin 參與肝癌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞EMT 過程[15-16]。β-catenin 是誘導(dǎo)EMT 的重要信號通路，未活化的β-catenin 與E-cadherin 結(jié)合，可維持上皮細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞間的黏附作用，當(dāng)E-cadherin 表達(dá)被抑制，β-catenin 轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中不斷累積，達(dá)到一定水平后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，促進(jìn)侵襲、遷移等靶基因的表達(dá)[17-18]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，GSK126 低、中、高劑量組p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 蛋白相對表達(dá)量均降低，且隨GSK126 劑量升高而降低，提示EZH2 抑制劑可能通過抑制JAK2/STAT3 信號通路中JAK2 和STAT3 蛋白磷酸化，抑制膀胱癌T24 細(xì)胞EMT，且具有劑量依賴性。JAK2/STAT3 信號通路是細(xì)胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵通路，JAK2 可通過激活下游STAT 級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移等過程。既往有研究顯示，抑制JAK2/STAT3 信號通路相關(guān)蛋白磷酸化可抑制胰腺癌[19]、腎細(xì)胞癌[20]的增殖和遷移，抑制腫瘤惡性生物學(xué)行為過程。因此，抑制特異性EZH2 表達(dá)能抑制膀胱癌EMT 過程，可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究應(yīng)用不同濃度EZH2 抑制劑均可抑制膀胱癌T24 細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力，且可有效抑制膀胱癌T24 細(xì)胞EMT 過程，其調(diào)控機(jī)制可能與抑制JAK2/STAT3 信號通路中JAK2 和STAT3蛋白磷酸化有關(guān)，可為臨床膀胱癌的精準(zhǔn)治療提供更多思路。