病毒性腦炎患兒血清microRNA-125b與病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系*

顧海紅，王培養(yǎng)，顧承萍，黃烈平，蔡荷飛

（1.舟山市婦女兒童醫(yī)院兒科，浙江舟山 316000；2.臺(tái)州市中心醫(yī)院兒科，浙江臺(tái)州 318000）

病毒性腦炎（viral encephalitis, VE）是一種中樞系統(tǒng)感染性疾病，由各種病毒直接侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起[1]。VE 的臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)熱、嘔吐、精神錯(cuò)亂、頭痛、精神障礙、意識(shí)障礙等[1]。全球流行病學(xué)資料顯示，VE 患兒的年發(fā)病率從3.5/10 萬(wàn)～7.4/10 萬(wàn)上升到16.0/10 萬(wàn)[2]。輕度VE 患兒如能得到快速準(zhǔn)確的診斷和治療，預(yù)后較好；嚴(yán)重的VE 患兒易出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，甚至死亡。VE的診斷較為復(fù)雜，由于其非特異性的臨床表現(xiàn)，目前主要通過(guò)腦脊液病原學(xué)檢查、磁共振成像、腦電圖等診斷[3]。這些傳統(tǒng)的診斷方法特異性、敏感性低，容易錯(cuò)過(guò)早期治療機(jī)會(huì)。早期臨床診斷和治療是降低發(fā)病率和病死率，改善預(yù)后的關(guān)鍵。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的迅速發(fā)展，核酸分析技術(shù)因高效和經(jīng)濟(jì)，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)、診斷等[4]。MicroRNA（miRNA）被證實(shí)在調(diào)控病毒感染中發(fā)揮重要作用，比如肝臟特異性的miR-122 促進(jìn)丙型肝炎病毒的復(fù)制，miR-32 限制靈長(zhǎng)類泡沫病毒1 型在人細(xì)胞中的積累等。MicroRNA-125b（miR-125b）作為一種高豐度的miRNA，廣泛參與各種細(xì)胞的代謝過(guò)程，比如腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移及凋亡[5-6]。有研究表明，miR-125b 是預(yù)測(cè)多種癌癥化學(xué)藥物治療反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的生物標(biāo)志物之一[6-7]。miR-125b 靶向于3＇-人類免疫缺陷病毒的mRNA，從而限制病毒復(fù)制[8]。另外，也有研究表明miR-125b 與慢性乙型肝炎感染密切相關(guān)[4,9]。因此，探索miR-125b 在調(diào)控病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)制中的作用可能有助于開(kāi)發(fā)新的治療方法用于病毒性疾病。然而，目前對(duì)VE 患兒血清miR-125b 的研究相對(duì)較少，本研究著重于分析血清miR-125b 與VE 患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2020年3月在舟山市婦女兒童醫(yī)院兒科就診的118 例VE 患兒為病例組。其中，男性60 例，女性58 例；年齡2～13 歲，平均（6.63±3.88）歲；體重（24.99±10.61）kg。另取同期本院40例健康體檢兒童作為對(duì)照組。其中，男性21 例，女性19 例；年齡1～13 歲，平均（6.72±2.19）歲；體重（25.79±11.01）kg。兩組兒童性別、年齡及體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，納入對(duì)象簽訂知情同意書。

病例組按VE 嚴(yán)重程度分為輕度組（63 例）和重度組（55 例）。輕度組僅包括伴有頭痛、頭暈和頸部僵硬等癥狀；重度組患兒表現(xiàn)為意識(shí)障礙、譫妄、不安、腦神經(jīng)麻痹、肢體癱瘓、不自主運(yùn)動(dòng)、泌尿系統(tǒng)紊亂和抽搐。本研究一共鑒定出10 種病毒，包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒A 和B、埃可病毒、流行性腮腺炎病毒、單純皰疹病毒及腺病毒等。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)①急性或亞急性發(fā)作；②有腦實(shí)質(zhì)病變的癥狀和體征；③發(fā)病前1 周出現(xiàn)呼吸道感染、腹瀉或發(fā)熱；腮腺炎或三叉神經(jīng)帶狀皰疹；④腦脊液常規(guī)檢查異常；⑤腦電圖異常；⑥PCR 檢查病毒陽(yáng)性。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)自身免疫性腦炎、膿毒癥相關(guān)性腦病等。

1.3 標(biāo)本收集與處理

病例組患兒在入院后第2 天上午6∶00～9∶00穿刺抽取靜脈全血10 mL，置于抗凝管。對(duì)照組兒童于體檢當(dāng)天上午6∶00～9∶00 空腹采集等體積靜脈全血。按照標(biāo)準(zhǔn)Ficoll 密度梯度離心，將血漿置于1 mL 無(wú)核酸酶EP 管（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），置于超低溫冰箱保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-125b的表達(dá)

按照RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司）說(shuō)明書提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)血清miR-125b相對(duì)表達(dá)量。miR-125b和miR-16（內(nèi)參基因）的引物分別為5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT ATTCGCACTGGATACGACTCACAG-3'和5'-AAAATA TGGAACGCTTCACGAATTTG-3'，長(zhǎng)度50 bp。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品平行測(cè)試3 次，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=ΔCt病例組-ΔCt對(duì)照組，ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因。

1.5 VE患兒的治療及結(jié)局

VE 患兒保持呼吸道通暢，維持水電解質(zhì)平衡、氧氣攝入和能量供應(yīng)。對(duì)高熱患兒采用物理降溫和醫(yī)學(xué)降溫治療，必要時(shí)進(jìn)行人工冬眠。采用中西醫(yī)結(jié)合抗病毒治療，嚴(yán)重者靜脈注射免疫球蛋白。對(duì)顱內(nèi)壓升高和驚厥患兒分別采用對(duì)癥治療。呼吸衰竭患兒采用輔助通氣治療，危重患兒送至兒童重癥監(jiān)護(hù)室。患兒在治療3 周后進(jìn)行評(píng)估。神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥（痛、意識(shí)障礙、精神癥狀、驚厥）患兒納入預(yù)后不良組，無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)異常者納入預(yù)后良好組。其中不良預(yù)后組39例，男性21例，女性18例；年齡（6.82±3.76）歲；肢體癱瘓6 例，語(yǔ)言障礙5 例，智力遲鈍8 例，癲癇7 例，視力障礙1 例；≥2 種后遺癥10例；2例死亡。預(yù)后良好組79例，男性39例，女性40 例；年齡（6.54±3.76）歲。預(yù)后不良組與預(yù)后良好組性別、年齡等基線特征比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用Tukey 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線；影響因素的分析采用單因素和多因素Logistic 回歸模型；相關(guān)性分析用Spearman 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-125b相對(duì)表達(dá)量比較

重度組、輕度組、對(duì)照組miR-125b 相對(duì)表達(dá)量分別為（2.81±0.54）、（1.9±0.26）和（1.0±0.51），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.339，P=0.006）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：對(duì)照組miR-125b 相對(duì)表達(dá)量低于輕度組和重度組（P＜0.05）；重度組miR-125b 相對(duì)表達(dá)量高于輕度組（P＜0.05）。

2.2 血清miR-125b 與VE 患兒臨床癥狀的關(guān)系

在VE 患兒中，血清miR-125b 與年齡、發(fā)熱、意識(shí)障礙、低鈉血癥、無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；血清miR-125b 與驚厥、多器官損傷、應(yīng)激性高血糖及偏癱呈正相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 VE患兒臨床癥狀與血清miR-125b的相關(guān)性

2.3 血清miR-125b對(duì)VE患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

血清miR-125b 預(yù)測(cè)VE 患兒預(yù)后的曲線下面積（area under the curve, AUC）為0.843；當(dāng)截?cái)嘀禐?.725 時(shí)，診斷敏感性為87.5%（95% CI：0.752，0.891）、特異性為71.2%（95% CI：0.812，0.921）、準(zhǔn)確性為76.4%（95 %CI：0.659，0.781），具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-125b預(yù)測(cè)VE患兒預(yù)后的ROC曲線

2.4 VE患兒預(yù)后影響因素的單因素分析

表2 VE患兒預(yù)后影響因素的單因素分析參數(shù)

2.5 VE患兒預(yù)后影響因素的多因素分析

采用逐步多因素Logistic 回歸模型分析驚厥、偏癱、多器官損傷、應(yīng)激性高血糖、miR-125b 對(duì)預(yù)后的影響，引入水準(zhǔn)為0.05，剔除水準(zhǔn)為0.10，結(jié)果：驚厥[=4.634（95% CI：1.497，15.752）]、應(yīng)激性高血糖[=6.931（95% CI：1.144，43.271）]和miR-125b [=5.647（95% CI：1.155，28.276）]是VE 患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 VE患兒預(yù)后影響因素的多因素分析參數(shù)

3 討論

VE 是病毒直接感染引發(fā)神經(jīng)功能障礙的腦實(shí)質(zhì)炎癥。VE 的臨床表現(xiàn)多樣，預(yù)后差，早期診斷及治療是影響預(yù)后的重要因素。由于疾病的復(fù)雜性、缺乏特異性的臨床癥狀及有限的診斷設(shè)備，使VE 患兒的診斷具有挑戰(zhàn)性。因此，尋求新的VE 診斷方法成為急需解決的問(wèn)題。

miR-125b 有miR-125b-1 和miR-125b-2 2 個(gè)前體，其編碼基因分別位于第11 號(hào)染色體和第21 號(hào)染色體上，但是兩者具有相同成熟的miR-125b 堿基序列[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，在不同的惡性腫瘤中，miR-125b作用不同，miR-125b 的表達(dá)在惡性腫瘤的診斷及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者中，血清miR-125 相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其與患者臨床癥狀密切相關(guān)，比如與肝細(xì)胞癌腫瘤大小、肝硬化及TNM 分期有關(guān)[11]。miR-125 診斷原發(fā)性肝細(xì)胞癌的AUC 為0.917，敏感性和特異性高達(dá)85.9%和93.5%。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-125b 在感染性疾病中具有重要作用。血清miR-125b 預(yù)測(cè)VE 患兒預(yù)后的AUC 為0.843；當(dāng)截?cái)嘀禐?.725 時(shí)，診斷敏感性（87.5%）、特異性（71.2%）和準(zhǔn)確性（76.4%）最高，具有良好的預(yù)后價(jià)值。這些發(fā)現(xiàn)與其他感染性疾病類似。在膿毒癥中，miR-125b可以減少心肌單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的趨化、聚集，降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）等炎癥因子的表達(dá)，減輕膿毒癥對(duì)心臟的損傷，提高生存率[12-13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b 在VE 患兒中高表達(dá)，且重度組也高于輕癥組，提示miR-125b 與VE 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。分析其原因，可能與炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 是miR-125b 的靶基因之一，同時(shí)miR-125b 的過(guò)度表達(dá)可能減少和抑制TNF-α 的合成。有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 與VE 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[13]，本研究中重度組miR-125b 高于輕癥組，提示當(dāng)疾病程度加重時(shí)，miR-125b發(fā)揮正反饋保護(hù)作用。另外，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在VE 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有高特異性，與VE 的病理過(guò)程及發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[14]。另外也有研究報(bào)道，VEGF基因翻譯存在miR-125b 結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)基因相互作用推測(cè)，VEGF可能是miR-125b 的靶基因之一，可被miR-125b 過(guò)表達(dá)下調(diào)。

另外，本研究還證實(shí)驚厥、偏癱、多器官損害、應(yīng)激性高血糖、miR-125對(duì)VE患兒預(yù)后有影響。并且癲癇、應(yīng)激性高血糖和miR-125b 是VE 患兒預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。有證據(jù)支持癲癇發(fā)作時(shí)間與VE 預(yù)后密切相關(guān)，發(fā)作時(shí)間越長(zhǎng)，預(yù)后越差[9]。影響預(yù)后的另一個(gè)危險(xiǎn)因素是應(yīng)激性高血糖，其可加速內(nèi)環(huán)境紊亂，病情惡化被認(rèn)為是直接影響VE 預(yù)后的因素之一。此外，miR-125b 上調(diào)可促進(jìn)疾病增殖和遷移[15]，并證實(shí)可以作為胃癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究提示早期治療VE 時(shí)，需要密切關(guān)注癲癇狀態(tài)及血糖變化，避免出現(xiàn)VE所致的神經(jīng)功能障礙。

綜上所述，miR-125b 在VE 患兒中高表達(dá)，且與VE 病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示miR-125b 在VE 的預(yù)測(cè)和診斷中具有重要作用，有望為VE 的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。然而，miR-125b 在VE 中的作用機(jī)制尚不清楚，仍然需要探究miR-125b 在其他感染性疾病中的作用。