基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接預(yù)測(cè)雷公藤治療肝炎的潛在機(jī)制

衛(wèi)博文，張 瑋，陳亞飛，王海燕，曹 丹，蔣楊雨，李 健

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 102488)

近年來，雷公藤防治各類肝臟病的藥效及藥理作用引起研究者的廣泛重視。已有的基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果表明，雷公藤提取物和制劑對(duì)病毒性肝炎[1-3]、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[4]、免疫性肝炎[5-6]、糖尿病肝損傷[7]等均有很好的改善作用，但是相關(guān)分子藥理機(jī)制尚未完全揭示。雷公藤制劑使用不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)毒副作用，影響肝、腎功能，是研究“藥效/毒性”轉(zhuǎn)化的理想藥物，其相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)、在靶和脫靶效應(yīng)、分子藥理和毒理機(jī)制的研究亟待深入開展。本課題組前期研究中，應(yīng)用常規(guī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討了雷公藤的藥理、毒理作用及可能的作用機(jī)制[8]。然而，受數(shù)據(jù)庫及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)的限制，前期的研究缺乏具體指向性以及對(duì)特定靶標(biāo)、通路的解析，獲得的預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)藥物研發(fā)及臨床應(yīng)用指導(dǎo)意義有限。為此，本研究以肝炎為研究體系，整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，構(gòu)建雷公藤活性化合物與的肝炎靶點(diǎn)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，預(yù)測(cè)雷公藤治療各類肝炎的潛在藥理機(jī)制，為中藥新藥的研發(fā)和藥物安全使用提供理論依據(jù)。

1 方法及流程

1.1雷公藤活性成分及靶點(diǎn)搜集 以“雷公藤”為關(guān)鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/)中檢索并篩選活性成分(OB≥30%及DL≥0.18)[9]，用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行校正。

1.2雷公藤活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將雷公藤活性成分、靶點(diǎn)等信息導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2軟件，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(drug-target network)”，做可視化處理及網(wǎng)絡(luò)解析。以節(jié)點(diǎn)度(Degree)的大小表示可視化網(wǎng)絡(luò)中該節(jié)點(diǎn)與其關(guān)聯(lián)的節(jié)點(diǎn)之間相連線段的條目數(shù)，Degree值越大表示該節(jié)點(diǎn)在可視化網(wǎng)絡(luò)中起到的作用越大，并用節(jié)點(diǎn)的重要程度進(jìn)行雷公藤中的重要活性成分篩選。

1.3肝炎疾病靶點(diǎn)采集、篩選 以“Hepatitis”為關(guān)鍵詞，在GeneCards(http://www.genecards.org/)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)和OMIM(https://omim.org/)數(shù)據(jù)庫中搜索疾病靶點(diǎn)，經(jīng)數(shù)據(jù)清洗、去重，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4雷公藤和肝炎共有靶點(diǎn)的篩選及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將雷公藤和肝炎的靶點(diǎn)提交至Jvenn網(wǎng)站(http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)，篩選二者共有靶點(diǎn)，并使用韋恩圖呈現(xiàn)。共有靶點(diǎn)信息上傳至String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建可視化PPI網(wǎng)絡(luò)(Protein-Protein interaction network)，根據(jù)所得Degree值，應(yīng)用R軟件繪制直方圖。進(jìn)而，將共有靶點(diǎn)信息上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果按P值升序排列(P≤0.05)，選出排序前10的生物過程、分子功能及細(xì)胞組分，提交至微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)做可視化處理，并應(yīng)用Cytoscape構(gòu)建雷公藤“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型。

1.5分子對(duì)接 選取雷公藤活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中Degree前5名的化合物(山柰酚、雷公藤甲素、β-谷固醇、諾比列汀、豆甾醇)和PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree最高的8個(gè)靶點(diǎn)分子AKT1(PDBID:4EKL)、CXCL8(PDBID:4XDX)、JUN(PDBID:5FV8)、STAT3(PDBID:6NJS)、TNF(PDBID:5MU8)、TP53(PDBID:3Q05)、VEGFA(PDBID:4KZN)、PTGS2(PDBID:5F1A)，用PYMOL、AutoDockTools和AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接處理。

2 結(jié) 果

2.1雷公藤和肝炎共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索，篩選出51個(gè)活性化合物，清洗后納入28個(gè)組分及146個(gè)靶標(biāo)分子。用Cytoscape 軟件構(gòu)建藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)(見圖1)，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)高連接區(qū)化合物，即山柰酚、雷公藤甲素、β-谷固醇、諾比列汀、豆甾醇。經(jīng)檢索Genecard、OMIM和PubMed數(shù)據(jù)庫，獲得肝炎相關(guān)分子(基因、蛋白)11 654個(gè)。將藥物靶標(biāo)和肝炎相關(guān)分子信息上傳至Jvenn網(wǎng)站，獲得二者共有靶點(diǎn)135個(gè)(見圖2)，用String數(shù)據(jù)庫繪制PPI網(wǎng)絡(luò)(見圖3)和Degree柱狀圖(見圖4)。其中Degree≥60的節(jié)點(diǎn)包括：AKT1、TNF、TP53、VEGFA、JUN、CXCL8、STAT3、PTGS2。

2.2共有靶點(diǎn)富集分析 通過構(gòu)建雷公藤的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型，直觀地呈現(xiàn)了雷公藤的28種活性成分、135個(gè)共同靶點(diǎn)、20條信號(hào)通路和肝炎靶標(biāo)間的關(guān)聯(lián)模式，見圖5。GO分析顯示：雷公藤可能干預(yù)的生物過程涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、藥物的反應(yīng)(response to drug)、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(positive regulation of transcription, DNA-templated)等，與之有關(guān)的細(xì)胞組分涉及有質(zhì)膜(plasma membrane)、細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)等，相對(duì)應(yīng)的分子功能有蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白質(zhì)同源二聚體活性(protein homodimerization activity)等(見圖6)。經(jīng)KEGG富集分析，前20個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路涉及代謝、凋亡、炎癥等相關(guān)信號(hào)通路，包括：PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway)和Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)等(見圖7)。

2.3分子對(duì)接結(jié)果 AKT1與諾比列汀和雷公藤甲素，CXCL8與β-谷固醇和豆甾醇，PTGS2與山柰酚具有強(qiáng)相互作用(見表1)。如圖8所示，氨基酸殘基Asp439、Glu234與諾比列汀形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Tyr437、Phe438、Phe442、Leu156、Gly157、Val164、Ala177、Lys179、Met227、Asp292、Thr291、Glu278、Met281與諾比列汀形成疏水相互作用。如圖9所示，A氨基酸殘基Asp292與雷公藤甲素形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Thr291、Met281、Phe438、Leu156、Val164、Lys179、Gly159、Thr160與雷公藤甲素形成疏水相互作用。如圖10所示，氨基酸殘基Phe65、Leu25、Ile39、Ile28、Lys3與β-谷固醇形成疏水相互作用。如圖11所示，氨基酸殘基Ala69、Phe65、Leu25、Val27與豆甾醇形成疏水相互作用；如圖12所示，氨基酸殘基Ala199、His207、Tyr385與山柰酚形成氫鍵相互作用，氨基酸殘Leu391、Leu390、His386、Asn382、Phe210、Thr206、Ala202、Gln203與山柰酚形成疏水相互作用。

表1 對(duì)接得分表(kcal/mol)

3 討 論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于多向藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)及網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)等技術(shù)，利用多種數(shù)據(jù)分析工具，構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，解析藥物與疾病間關(guān)系的一門融合類交叉學(xué)科[10]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略對(duì)于解析中藥多組分、多靶點(diǎn)、多功效的作用機(jī)制非常契合，其預(yù)測(cè)得到的藥物靶點(diǎn)、通路等結(jié)果與“濕法”實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，不僅能提高新藥研發(fā)、藥理機(jī)制解析的效率，而且能極大地節(jié)約研究成本[11-13]。

在課題組前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步解析了雷公藤中山柰酚、雷公藤甲素、β-谷甾醇、諾比列汀、豆甾醇等化合物可能的作用機(jī)制，即通過AKT1、TNF、TP53、VEGFA等靶點(diǎn)以及調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等發(fā)揮肝炎的治療作用。已有的文獻(xiàn)表明，山柰酚是一種類黃酮，具有治療炎性疾病的潛力[14]，可以通過抑制IL-4[15]、CRP、COX-2等的表達(dá)以及下調(diào)肝細(xì)胞中NF-κB的含量而表現(xiàn)出抗炎作用[16]。雷公藤甲素具有抗癌[17]、免疫抑制和抗炎[18]等藥理活性，可以調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和趨化因子如IFN-γ[19]、IL-8[20]、COX-2和NO[21]等來抑制炎癥并增強(qiáng)細(xì)胞的保護(hù)作用。雷公藤甲素還通過參與調(diào)節(jié)活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)[22]，調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，觸發(fā)自噬[23]并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程[24]。β-谷甾醇具有抗高脂血癥、抗炎和抗腫瘤作用，同時(shí)還可以預(yù)防非酒精性脂肪肝疾病。此外，有研究表明，β-谷甾醇在脂多糖激活的J774A.1巨噬細(xì)胞中顯示較好的抗炎作用，能顯著抑制NF-κB的激活，抑制COX-2及CSF-1的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)[25-26]。諾比列汀具有抗氧化、抗炎[27-28]活性，可以調(diào)節(jié)SIRT-1/FOXO3a介導(dǎo)的自噬和SIRT-1/PGC-1α介導(dǎo)的線粒體機(jī)制，誘導(dǎo)線粒體自噬，從而保護(hù)肝臟免受缺血/再灌注引發(fā)的損傷[29]。豆甾醇則具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，其抗炎及治療關(guān)節(jié)炎的作用已被證明[30-31]。

本研究結(jié)果提示，AKT1、CXCL8和PTGS2可能成為雷公藤的潛在作用靶標(biāo)。其中AKT1是PI3K信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，參與調(diào)節(jié)許多生物過程，包括物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖和血管生成[32]。有證據(jù)表明AKT1參與急性炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展和血管通透性的急性改變[33]。CXCL8又稱IL-8，是在炎癥微環(huán)境中產(chǎn)生的CXC型趨化因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中CXCL8信號(hào)失調(diào)，加劇腫瘤微環(huán)境的炎癥狀態(tài)，從而幫助癌細(xì)胞從原發(fā)部位向外周遷移[34-35]。PTGS2可引起炎癥和氧化應(yīng)激損傷，參與前列腺素合成的PTGS2可以在多種肝臟病理組織中檢測(cè)到[36]。已有的研究提示，肝細(xì)胞內(nèi)PTGS2的過表達(dá)可抑制促炎細(xì)胞因子，增加抗凋亡作用，并通過激活A(yù)KT和AMPK信號(hào)抑制肝組織炎癥反應(yīng)[37-39]。

借助GO富集分析及KEGG功能分析，AKT1、CXCL8和PTGS2與PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等相關(guān)。其中，PI3K-Akt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在許多細(xì)胞過程(包括RNA加工、翻譯和凋亡)中起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，而與PI3K或AKT亞型拮抗的化合物則有望成為調(diào)節(jié)炎癥和自身免疫性疾病的藥物靶標(biāo)[40]。TNF信號(hào)通路可以介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(c-fos、c-jun)的mRNA表達(dá)和炎癥細(xì)胞因子的水平等[41]。Toll樣受體(TLR)是膜結(jié)合受體，哺乳動(dòng)物Toll樣受體在固有免疫細(xì)胞上表達(dá)，Toll樣受體信號(hào)通路可以識(shí)別病原體，快速激活固有免疫，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和上調(diào)共刺激分子，導(dǎo)致多種炎癥基因表達(dá)[42]。

本研究應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)初步驗(yàn)證了雷公藤中5種主要活性成分與肝炎關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白具有較好的親和力，進(jìn)而提示：從雷公藤中有望發(fā)現(xiàn)并開發(fā)出防治各類肝炎的新藥，其潛在靶標(biāo)及其相關(guān)信號(hào)通路為進(jìn)一步解析雷公藤的分子藥理機(jī)制提供了明確研究方向。目前，本課題組正在依托細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過敲低(knock down)和過表達(dá)AKT1、CXCL8和PTGS2基因，對(duì)雷公藤的分子藥理機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期產(chǎn)出一系列原創(chuàng)性成果。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。