靶向生長抑素受體SSTR2的新型白蛋白親和放射性碘標(biāo)記分子探針的制備與評價(jià)

林曉茹，方建陽，李靖超，郭志德，張現(xiàn)忠

(廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子影像暨轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，福建 廈門 361102)

生長抑素受體(somatostatin receptor,SSTR)屬于G蛋白偶聯(lián)膜受體超家族，分為SSTR1～5共5種受體亞型[1]，其中SSTR2在90%的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(neuroendocrine tumor,NET)中高表達(dá)[2]，已成為腫瘤診斷和治療中有潛力的靶點(diǎn)[3-5].由于奧曲肽衍生物Tyr3-octreotate(TATE)可以與NET細(xì)胞表面的SSTR2高特異性、高選擇性結(jié)合[6]，所以使用放射性核素對該肽進(jìn)行標(biāo)記引起廣泛關(guān)注.如68Cu對1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)-TATE進(jìn)行標(biāo)記得到的[68Cu]Cu-DOTA-TATE，其NET正電子發(fā)射斷層顯像(position emission computed tomography,PET)的靈敏度和特異性均高達(dá)90%以上[7].此外，使用90Y或177Lu等核素標(biāo)記DOTA-TATE，所獲得的標(biāo)記化合物可用于腫瘤的肽受體放射性核素治療(peptide receptor radionuclide therapy,PRRT)[8-9].對于表達(dá)生長抑素的腫瘤患者，PRRT可以用于治療不適合手術(shù)切除的患者.177Lu標(biāo)記的TATE([177Lu]Lu-DOTA-TATE)已于2018年1月被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于治療SSTR陽性的胃腸胰腺NET(GEP-NET)，是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于GEP-NET的放射性藥物[9].在一項(xiàng)涉及晚期SSTR陽性GEP-NET患者的臨床試驗(yàn)中，與單獨(dú)接受奧曲肽的患者相比，[177Lu]Lu-DOTA-TATE治療可獲得更長的無進(jìn)展生存期，這意味著接受[177Lu]Lu-DOTA-TATE治療的患者的腫瘤生長風(fēng)險(xiǎn)或死亡風(fēng)險(xiǎn)更低.盡管[177Lu]Lu-DOTA-TATE對治療NET的患者有效，但該肽在血液中快速清除且通過腎臟代謝，限制了其在核素治療中的進(jìn)一步應(yīng)用[10-12].從成像層面來說，快速的血液清除率可降低正常組織的放射毒性，提高探針在體內(nèi)的靶標(biāo)/本底比值，因此在腫瘤的受體靶向顯像中通常被認(rèn)為是一項(xiàng)優(yōu)勢.然而，在治療層面，如果藥物在血液中快速清除，那么會造成藥物與靶標(biāo)結(jié)合不充分，這就需要加大劑量[13].提高探針在血液中的循環(huán)時(shí)間能有助于提高探針和受體的結(jié)合[14].因此，較長的血液循環(huán)半衰期對于腫瘤PRRT是必要的[15]，其療效很大程度上取決于標(biāo)記化合物的藥代動力學(xué)[16].大部分多肽類核素標(biāo)記化合物用于核素治療時(shí)，其療效常受到血液循環(huán)半衰期短的限制[17]，而多次給藥方式不僅提高了醫(yī)療成本，也增加了副作用的發(fā)生率[18].因此，延緩探針的血液循環(huán)半衰期，提高核素在靶標(biāo)部位的絕對攝取值，成為獲得更好療效的一種有益嘗試[19].

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)(50 mg/mL).自20世紀(jì)90年代中期開始，HSA作為一種運(yùn)輸?shù)鞍妆粡V泛研究，通常被用于延長靶向炎癥或腫瘤藥物的生物半衰期[20-21].通過共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的方式將藥物與白蛋白結(jié)合分子(albumin-binding molecule,ABM)連接到一起，經(jīng)靜脈注射入體內(nèi)后形成白蛋白-結(jié)合基團(tuán)-藥物的三合體，能使治療藥物在體內(nèi)的血液循環(huán)時(shí)間大幅延長，降低腎臟攝取的同時(shí)提高藥物在腫瘤部位的攝取[22-23].

因此，本研究試圖將白蛋白親和基團(tuán)修飾到TATE上，并通過延長多肽的血液循環(huán)半衰期來提高腫瘤攝取.伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)分子對TATE的修飾策略已被證明是一種有效的提高探針?biāo)幋鷦恿W(xué)性質(zhì)的途徑.研究表明EB-TATE較TATE單體的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間有明顯延長，在提高探針腫瘤攝取的同時(shí)降低其腎臟中的放射性滯留[15,24-25].但EB的合成較為繁瑣，需要在分子中引入雙功能螯合劑1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)或DOTA才能進(jìn)行核素標(biāo)記.4-碘苯基丁酸(p-iodophenylbutyric acid,IPBA)是從DNA編碼的化學(xué)庫中篩選出的一類小分子化合物，可以和HSA以穩(wěn)定的非共價(jià)形式結(jié)合，從而大大減緩其從體內(nèi)清除的速率[26-28].已有研究發(fā)現(xiàn)，將IPBA小分子與不同靶向分子結(jié)合，探針的血液循環(huán)時(shí)間有效延長，在腫瘤中的攝取率隨之增加[29-32].近期，本課題組開發(fā)了一種新型的放射性碘標(biāo)記方法，在銅介導(dǎo)下放射性碘離子與芳香族苯硼酸類化合物Ar-B(OH)2發(fā)生氧化取代反應(yīng)，即可實(shí)現(xiàn)放射性碘的標(biāo)記[33-36]，整個(gè)標(biāo)記過程具有反應(yīng)簡單快速、標(biāo)記率高等優(yōu)點(diǎn).因此，本研究利用該反應(yīng)對4-(4-硼酸基苯基)丁酸活化酯(4-BBA-NHS)結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記，以獲得放射性碘標(biāo)記的[131I]IPBA-NHS，并進(jìn)一步通過酰胺化反應(yīng)得到靶向SSTR2的新型白蛋白親和探針[131I]IPBA-TATE，期望能夠通過延長探針的血液半衰期來提高探針在腫瘤中的攝取率.值得一提的是，應(yīng)用于生命科學(xué)的放射性碘同位素種類較多(131I、125I、124I、123I等)，可選擇性用于PET/單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(single photon emission computed tomography,SPECT)，亦可用于放射性靶向治療，是核素診療一體化平臺的重要組成部分.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器

分析天平(Discovery,OHAUS)，放射性核素活度計(jì)(CRC-15R,CAPINTEC)，高效液相色譜(HPLC)儀(Thermo)，高分辨質(zhì)譜(Waters)，伽馬計(jì)數(shù)器(WIZARD 2480,Perkin-Elmer)，離心機(jī)(H1650，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司).

1.1.2 主要試劑與耗材

1,10-鄰菲羅啉(百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)，氯化銅(CuCl2)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，無水乙腈、正辛醇(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)，HSA(Solarbio)，胎牛血清(FBS)、F-12K液體培養(yǎng)基(Gibco BRL)；超濾離心管(北京明陽科華生物技術(shù)有限公司)，C-18反相放射性HPLC柱(內(nèi)徑4.6 mm,柱長250 mm,粒徑5 μm,孔徑120 nm, Thermo)，C-18小柱(Waters).

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞系

所用的表達(dá)SSTR2的AR42J大鼠胰腺外分泌腺腫瘤細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞研究資源中心.BALB/c正常小鼠及裸小鼠(6～8周，體質(zhì)量為18～20 g，雄性)來源于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，所有動物實(shí)驗(yàn)操作均符合倫理規(guī)范.

細(xì)胞培養(yǎng)：將AR42J細(xì)胞置于含20%(體積分?jǐn)?shù))FBS的F-12K液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2和95%(體積分?jǐn)?shù))空氣.

AR42J模型小鼠的建立：將AR42J細(xì)胞(1×107個(gè)，100 μL)接種于裸鼠右上肢部位，接種完畢后形成皮下球狀體，隔日觀察小鼠成瘤及腫瘤生長情況，待腫瘤直徑生長至7～10 mm時(shí)用于生物分布研究.

1.2 放射化學(xué)合成

本研究合成了兩種基于TATE結(jié)構(gòu)的放射性碘標(biāo)記分子[131I]IPBA-TATE和[131I]4-碘苯甲酸(IBA)-TATE，其放射化學(xué)合成路線如圖1所示.

DDE.1-(4,4-二甲基-2，6-二氧代環(huán)己-1-亞基)乙基.

1.2.1 [131I]IPBA-NHS和[131I]IBA-NHS的放射性碘標(biāo)記

采用本課題組開發(fā)的基于銅催化的苯硼酸放射性碘標(biāo)記法[35]，具體過程為：取37 MBq[131I]NaI，氮?dú)獯蹈?，加? mg 4-BBA-NHS或4-BA-NHS，隨后加入50 μL催化劑(11.6 mg Cu2O, 31 mg 1,10-鄰菲羅啉溶于3 mL無水乙腈混合液)，50 ℃下反應(yīng)30 min，通過HPLC進(jìn)行分析.

1.2.2 [131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE的合成

取1 mg TATE溶于DMSO中，加入5 μL DIPEA后將混合液加入放射性碘標(biāo)記的[131I]IPBA-NHS或[131I]IBA-NHS，50 ℃下反應(yīng)30 min；隨后加入5 μL水合肼，室溫下反應(yīng)10 min.通過HPLC進(jìn)行分離純化，純化條件如表1所示.紫外檢測波長為254 nm，流速為1 mL/min.

表1 [131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE的HPLC純化條件

1.3 脂水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)

脂水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行操作[37-38].取純化后的[131I]IPBA-TATE或[131I]IBA-TATE(370 kBq)于2.5 mL的1號EP管中，加入正辛醇和磷酸鹽緩沖液(PBS)各1 mL，密封后渦旋3 min，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min后，從有機(jī)相中取出100 μL于2號EP管中；然后加入900 μL正辛醇和1 mL PBS，再次密封后渦旋3 min，以同樣的轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)3次，分別取100 μL的有機(jī)相和水相于不同的EP管中，平行取樣3次；最后用伽馬計(jì)數(shù)器測量每個(gè)離心管中的放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算脂水分配系數(shù)對數(shù)logP.

1.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取370 kBq的[131I]IPBA-TATE或[131I]IBA-TATE分別置于PBS、生理鹽水和FBS中，在37 ℃下孵育24 h，用HPLC分析放射化學(xué)純度.

1.5 白蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)

1.5.1 超濾離心實(shí)驗(yàn)

參照已有方法[36]，取37 kBq純化后的[131I]IPBA-TATE或[131I]IBA-TATE溶于1 mL PBS中，加入5 mg HSA,在室溫下孵育20 min后轉(zhuǎn)移至超濾離心管中,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，收集下層溶液;再往上層加入500 μL PBS，以同樣的轉(zhuǎn)速離心5 min，重復(fù)3次，收集下層溶液;最后用伽馬計(jì)數(shù)器測定離心管上、下層的活度.

1.5.2 透析實(shí)驗(yàn)

根據(jù)已有方法[39-40]進(jìn)行透析實(shí)驗(yàn)，具體操作步驟如下：取5 mg HSA溶于5 mL pH 7.4的PBS中.實(shí)驗(yàn)組加入200 μL(7.4 MBq)的[131I]IPBA-TATE和5 mL HSA溶液(PBS配制)，對照組加入200 μL(7.4 MBq)的[131I]IPBA-TATE和5 mL PBS；室溫下孵育20 min后，分別將實(shí)驗(yàn)組和對照組中的溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(截留分子質(zhì)量7 ku)，并于裝有1 L超純水的透析桶中進(jìn)行透析.用伽馬計(jì)數(shù)器測量不同時(shí)間點(diǎn)透析膜內(nèi)和超純水中的放射性計(jì)數(shù)，每組3個(gè)重復(fù)樣本.按上述步驟進(jìn)行[131I]IBA-TATE的透析實(shí)驗(yàn).

1.5.3 藥代動力學(xué)測定

在實(shí)驗(yàn)前3 d，將含有0.12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))碘化鉀的飲用水對BALB/c小鼠進(jìn)行喂養(yǎng)，以抑制甲狀腺對碘離子的攝取.將14.8 MBq[131I]IPBA-TATE或[131I]IBA-TATE通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)(0.5，2，4，8和24 h)通過眼眶取血的方式收集小鼠血液并稱量，用伽馬計(jì)數(shù)器測量血液中放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克血液中所攝取的放射性劑量占總注射放射性劑量的百分率(%ID/g).最后用DAS(Drug and Statistics)軟件計(jì)算血液末端清除半衰期(t1/2z，t1/2z=0.693/Zeta,Zeta為c-t曲線尾段斜率).

1.6 生物分布實(shí)驗(yàn)

選取正常BALB/c小鼠或AR42J荷瘤小鼠進(jìn)行生物分布實(shí)驗(yàn)，通過尾靜脈注射1.85 MBq[131I]IPBA-TATE或[131I]IBA-TATE，在給藥0.5,2,4,8和24 h 后處死.對小鼠進(jìn)行解剖并取出心、肝、脾、肺、腎、胃、骨、血、肉、腸、腦、子宮、卵巢、甲狀腺、腦等器官進(jìn)行稱量，用伽馬計(jì)數(shù)器進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織中所攝取的放射性劑量占總注射放射性劑量的百分率(%ID/g).

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)合成

通過高分辨質(zhì)譜對[127I]IPBA-TATE和[127I]IBA-TATE進(jìn)行鑒定：[127I]IPBA-TATE的[M+H+]質(zhì)荷比為1 304.25，[127I]IBA-TATE的[M+H+]質(zhì)荷比為1 261.28.用銅介導(dǎo)的苯硼酸標(biāo)碘方法進(jìn)行131I標(biāo)記，標(biāo)記過程簡單且具有較好的放射化學(xué)產(chǎn)率.[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE的部分理化性質(zhì)見表2，經(jīng)HPLC純化后得到放射化學(xué)純度大于95%且比活度高的標(biāo)記化合物(圖2)，通過脂水分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)測得[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE呈親脂性(logP>0).

表2 [131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE的理化性質(zhì)(n=3)

圖2 [131I]IPBA-NHS、[131I]IPBA-TATE(a)以及[131I]IBA-NHS、[131I]IBA-TATE(b)的HPLC譜圖

2.2 體外穩(wěn)定性

圖3為37 ℃下[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE在生理鹽水、PBS及FBS中孵育24 h的穩(wěn)定性情況.通過HPLC分析得131I-在該條件下的保留時(shí)間為2.5 min左右.[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE并未出現(xiàn)脫碘現(xiàn)象，且在不同條件下孵育24 h后其放射化學(xué)純度均大于95%，說明[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE具有良好的體外穩(wěn)定性.該結(jié)果與已報(bào)道的結(jié)果[35-36]一致.

圖3 [131I]IPBA-TATE(a)和[131I]IBA-TATE(b)在生理鹽水、PBS及FBS中孵育24 h后的體外穩(wěn)定性

2.3 白蛋白結(jié)合能力

通過超濾離心實(shí)驗(yàn)和透析實(shí)驗(yàn)兩種方法在體外定性研究[131I]IPBA-TATE與HSA的結(jié)合能力.通過測定小鼠體內(nèi)血液末端清除半衰期來評估靶向分子TATE連接到白蛋白結(jié)合分子IPBA后血液循環(huán)時(shí)間是否延長，以[131I]IBA-TATE作為對照組.

圖4(a)和(b)分別為[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE在體外與白蛋白的透析實(shí)驗(yàn)結(jié)果.隨著透析時(shí)間的延長，游離的[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE會從透析袋中析出，而結(jié)合了HSA的[131I]IPBA-TATE由于分子質(zhì)量增加會滯留在透析袋中.結(jié)果表明:在含有HSA的透析袋中透析24 h后，約(82.17±0.34)%[131I]IPBA-TATE仍滯留在透析袋中；而[131I]IBA-TATE僅滯留(48.85±0.51)%.在不含HSA的透析袋中透析24 h后，[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE的析出比例接近，均約50%.上述結(jié)果表明[131I]IPBA-TATE在體外能有效與白蛋白結(jié)合.

(a)～(b)透析實(shí)驗(yàn)；(c)超濾離心實(shí)驗(yàn)；(d)血液末端清除半衰期測定.

白蛋白結(jié)合超濾離心實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4(c)所示:實(shí)驗(yàn)組中，由于[131I]IPBA-TATE有效結(jié)合了HSA，分子質(zhì)量增大，主要放射性計(jì)數(shù)都保留在離心管上層；而[131I]IBA-TATE由于和HSA結(jié)合效率低，幾乎全被離心至下層.上述結(jié)果表明[131I]IPBA-TATE在體外具有較高的白蛋白結(jié)合能力，結(jié)合率約90%.

[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE在血液中的攝取情況如圖4(d)所示.[131I]IPBA-TATE的血液末端清除半衰期t1/2z=(25.50±3.35)h，約為[131I]IBA-TATE(t1/2z=(15.64±4.2)h)的1.6倍.體內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明[131I]IPBA-TATE具有更強(qiáng)的白蛋白結(jié)合能力，能夠達(dá)到延長血液末端清除半衰期的效果.

2.4 生物分布

2.4.1 正常小鼠中的生物分布

[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE在正常小鼠中的生物分布結(jié)果如圖5所示.通過尾靜脈分別注射[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE后，其主要分布在肝、腎及胃中，且隨著循環(huán)時(shí)間的延長放射性逐漸降低.在肝臟中的攝取率最高，說明這兩個(gè)探針均以肝臟代謝為主，主要原因可能是[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE呈親脂性，驗(yàn)證了2.1節(jié)結(jié)果中的推斷；在胃中也有明顯的放射性攝取，可能是由于SSTR2在胃中高表達(dá)所出現(xiàn)的生理性攝取，也可能是由于脫碘所致；但甲狀腺的攝取率較低(實(shí)驗(yàn)前并未對小鼠注射碘化鉀溶液以阻斷甲狀腺對游離碘離子的攝取)，說明[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE在體內(nèi)穩(wěn)定性較好.胃中的高放射性攝取可能是由于胃高表達(dá)SSTR2所出現(xiàn)的生理性攝取，也說明[131I]IPBA-TATE和[131I]IBA-TATE對SSTR2具有一定的親和力.不同的是，[131I]IPBA-TATE在腎臟中快速清除，在注射24 h后，腎臟中的攝取僅為(3.75±0.81)%ID/g；而[131I]IBA-TATE在腎臟中的攝取于4 h 達(dá)到最大值(13.64±1.44)%ID/g，并且在24 h仍有較高的攝取，為(5.81±1.33)%ID/g.此外，還發(fā)現(xiàn)[131I]IPBA-TATE相比于[131I]IBA-TATE在血液中有更高的放射性滯留，在0.5 h時(shí)分別有(10.41±2.79)%ID/g的[131I]IPBA-TATE和(4.55±2.01)%ID/g 的[131I]IBA-TATE在血液中滯留，且隨著血液循環(huán)時(shí)間的延長，[131I]IBA-TATE從血液中快速清除；而[131I]IPBA-TATE則清除緩慢，在注射24 h后仍有(3.30±0.50)%ID/g，這主要是由于[131I]IPBA-TATE可以和血液中的白蛋白結(jié)合.

圖5 通過尾靜脈注射0.5，2，4，8和24 h后[131I]IPBA-TATE(a)和[131I]IBA-TATE(b)在正常BALB/c小鼠中的生物分布

2.4.2 [131I]IPBA-TATE在AR42J荷瘤小鼠中的生物分布

基于正常小鼠中的生物分布情況，選取2和4 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)對[131I]IPBA-TATE在AR42J荷瘤小鼠主要器官中的生物分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示.荷瘤小鼠的生物分布同樣顯示[131I]IPBA-TATE在腎臟和肝臟中有高攝取，但其具體代謝途徑仍需通過排泄實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證；此外，在胃、脾、肺等器官中的放射性攝取率也較高.該探針在腫瘤中2和4 h的攝取分別為(0.48±0.18)%ID/g和(1.21±0.67)%ID/g，且具有較高的瘤/肉比，分別為3.53±1.44和5.30±2.07.[131I]IPBA-TATE在表達(dá)SSTR2的胃和腫瘤中均有明顯攝取，證明[131I]IPBA-TATE對SSTR2有一定的親和力，對AR42J腫瘤有一定的靶向性.血液末端清除半衰期的延長為該探針在靶器官的進(jìn)一步富集提供了可能.

圖6 通過尾靜脈注射2和4 h后[131I]IPBA-TATE在AR42J荷瘤小鼠中的生物分布

3 結(jié) 論

[131I]IPBA-TATE具有標(biāo)記方法簡便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地和白蛋白進(jìn)行結(jié)合，血液末端清除半衰期約為25.5 h.生物分布顯示[131I]IPBA-TATE能有效在腫瘤富集，且具有較高的瘤/肉比.但探針的親脂性較高，導(dǎo)致其在肝臟中的攝取較高.后續(xù)可通過在蛋白結(jié)合分子和靶向分子之間引入一定長度的親水性聚乙二醇，以達(dá)到改善探針?biāo)苄缘哪康?，從而降低探針在肝臟中的攝取.總的來說，[131I]IPBA-TATE是一種基于奧曲肽的新型白蛋白親和探針，有望用于SSTR2陽性腫瘤的SPECT顯像及放射性核素131I靶向治療.