液相色譜法測定紙吸管中丙烯酰胺遷移量的不確定度評定

錢 凱，劉麗娜，王 昕，張海燕

（1.常州工業(yè)及消費(fèi)品檢驗(yàn)有限公司，江蘇常州 213000；2.南京海關(guān)危險(xiǎn)貨物與包裝檢測中心，江蘇常州 213000）

隨著“升級版限塑令”的出臺和人們環(huán)保意識的提高，紙吸管作為塑料吸管的替代品逐漸受到餐飲行業(yè)的青睞。聚丙烯酰胺是造紙行業(yè)最早使用的一種添加劑，常用于提高紙張強(qiáng)度，還可用作助留劑、助濾劑等[1-3]。聚丙烯酰胺在自然條件下會降解為丙烯酰胺，同時(shí)殘留的丙烯酰胺單體也會隨著聚丙烯酰胺終產(chǎn)物引入紙吸管中，并在接觸食品過程中遷移出來[3-5]。研究顯示，丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性等毒性作用，且滲透性較強(qiáng)，易通過消化道、呼吸道等途徑被人體吸收，已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為Ⅱ類致癌物[2,4,6-8]。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 9685—2016）規(guī)定，紙和紙板材料及其制品中丙烯酰胺特定遷移量的限制要求為不得檢出（檢測低限為0.01 mg/kg）[9]。由于法規(guī)要求的檢出限值較低，而液相色譜法的靈敏度不高。因此，控制和提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性研究十分必要。測量不確定度是中國合格評定國家認(rèn)可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）認(rèn)可準(zhǔn)則要求的，用于表征檢測結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的一種有效方式[10]。本文采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品 丙烯酰胺遷移量的測定》（GB 31604.18—2016）方法，定量分析紙吸管樣品在體積分?jǐn)?shù)為4%乙酸水溶液中丙烯酰胺的特定遷移量[11]。通過建立特定遷移量的數(shù)學(xué)模型，分析考察影響測量結(jié)果的各不確定度分量來源，并依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）進(jìn)行不確定度的計(jì)算評定，對控制整個(gè)測量過程及提高檢測結(jié)果的質(zhì)量具有重要意義[12-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰乙酸（分析純，中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（色譜純，中國上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；硫酸（優(yōu)級純，永華化學(xué)股份有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為一級水；丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；親水PTFE針式濾器（25 mm×0.22 μm，中國上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XS205DU萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公 司）；Milli-Q Advantage純 水 儀（ 美 國Millipore公司）；BINDER FD260烘箱（德國Binder公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制

丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg/L）：準(zhǔn)確移取100 μL丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（1 000 μg/mL）于10 mL容量瓶中，用水定容。丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確移取丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液 30 μL、50 μL、80 μL、100 μL 和200 μL于10 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為4%的乙酸溶液定容，得到濃度分別為30 μg/L、50 μg/L、80 μg/L、100 μg/L和200 μg/L的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品制備

按 GB 31604.1—2015和 GB 5009.156—2016標(biāo)準(zhǔn)要求，采用4%乙酸溶液（體積分?jǐn)?shù)）作為食品模擬物，特定遷移試驗(yàn)條件為70 ℃，2 h。將紙吸管樣品置于合適的玻璃試管中，加入預(yù)熱至70 ℃的4%乙酸溶液（體積分?jǐn)?shù)），使樣品完全浸沒在溶液中，用錫箔紙密封試管口，置于70 ℃烘箱中保存2 h。浸泡結(jié)束后，將玻璃試管從烘箱中取出并冷卻至室溫，使遷移試驗(yàn)溶液充分混勻后，取其中1～2 mL溶液經(jīng)0.22 μm PTFE微孔濾膜過濾至2 mL進(jìn)樣小瓶，用于高效液相色譜分析測試。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：艾杰爾Venusil CIS 離子排斥色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：硫酸溶 液（0.003 6 mol/L）∶乙腈=91∶9；洗脫方式：等度洗脫；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測波長：198 nm。

1.3.4 特定遷移量的數(shù)學(xué)模型

紙吸管樣品中丙烯酰胺特定遷移量的計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品中丙烯酰胺的特定遷移量，mg/kg；C為食品模擬物中丙烯酰胺的濃度，mg/L；C0為空白試液中丙烯酰胺的濃度，mg/L；V為食品模擬物的體積，L；S為樣品與食品模擬物的接觸面積（以下稱接觸面積），dm2；f為特定遷移量換算系數(shù)。按GB 5009.156—2016標(biāo)準(zhǔn)要求，紙吸管樣品實(shí)際使用的接觸面積（S0）和接觸食品體積（V0）之比未知，因此f=6，dm2/kg。根據(jù)GB 31604.1—2015的基本要求，各種液態(tài)食品的密度通常以1 kg/L計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源

通過對實(shí)驗(yàn)過程和數(shù)學(xué)模型的輸入量進(jìn)行分析可知，測量紙吸管樣品中丙烯酰胺遷移量的不確定度因素主要有樣品測量面積、食品模擬物體積、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、校準(zhǔn)曲線擬合、高效液相色譜儀、加標(biāo)回收率和平行樣品測量的重復(fù)性。

2.2 不確定度評定

2.2.1 測量樣品面積引入的不確定度u(S)

由于紙吸管樣品近似于空心圓柱，因此樣品與食品模擬物的接觸面積（即浸泡面積）為樣品的側(cè)面積，需要測量樣品的直徑和長度兩個(gè)尺寸，測量結(jié)果分別為0.12 dm和2.30 dm，故樣品的浸泡面積S為0.867 dm2。根據(jù)《鋼直尺檢定規(guī)程》JJG 1-1999，本實(shí)驗(yàn)室的鋼直尺的示值誤差為±0.001 dm，假設(shè)測量服從均勻分布則測量樣品直徑引入的不確定度分量為。同理可知，測量樣品長度引入的不確定度分量為：

測量樣品面積引入的不確定度為：

2.2.2 遷移試驗(yàn)引入的不確定度u(V)

根據(jù)遷移試驗(yàn)過程可知，樣品在浸泡時(shí)引入的不確定度主要包括量筒容量偏差、量筒讀數(shù)偏差和浸泡溫度引起的體積偏差。

（1）食品模擬物的量取引入的不確定度。采用量程為250 mL的量筒量取130 mL配制好的4%乙酸溶液（體積分?jǐn)?shù)）。根據(jù)《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006），20 ℃時(shí)250 mL量筒的容量誤差為±1.0 mL，假設(shè)測量服從三角分布則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（2）量筒讀數(shù)引入的不確定度。由于操作人員的習(xí)慣不同，在讀取量筒數(shù)值時(shí)會存在讀數(shù)誤差。假設(shè)實(shí)驗(yàn)過程中允許的讀數(shù)誤差為±1%，且服從三角分布，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

（3）浸泡溫度引入的不確定度。由于遷移試驗(yàn)需將浸泡樣品的食品模擬物置于70 ℃的烘箱中，假設(shè)遷移試驗(yàn)過程中的溫度變化為±2 ℃，因無法查得4%乙酸溶液（體積分?jǐn)?shù)）在70 ℃時(shí)的膨脹系數(shù)，故近似視為水的膨脹系數(shù)0.022 69 /℃，服從均勻分布，則由浸泡溫度引入的不確定度為

因此，將3個(gè)不確定度分量加權(quán)平均計(jì)算得到由遷移試驗(yàn)引入的不確定度為：

2.2.3 測定浸泡液中丙烯酰胺濃度引入的不確定度u(C)

由于丙烯酰胺遷移量的測定是將遷移試驗(yàn)的浸泡溶液經(jīng)微孔濾膜過濾后直接采用高效液相色譜進(jìn)行分析，定量方法為外標(biāo)法。因此，其測定過程的不確定度來源主要為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、校準(zhǔn)曲線擬合及測量儀器。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度引入的不確定度u(ss)。查丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書顯示的擴(kuò)展不確定度U(ss)=2%，k=2，計(jì)算其相對不確定度為

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制引入的不確定度u(D)。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制過程是依次采用移液器量取標(biāo)準(zhǔn)溶液和容量瓶定容進(jìn)行濃度逐級稀釋，因此該過程引入的不確定度為移液器和容量瓶。根據(jù)不同量器具的校準(zhǔn)證書顯示的擴(kuò)展不確定度分別計(jì)算其相對不確定度分量，具體結(jié)果如表1所示。將各相對不確定度進(jìn)行加權(quán)平均即得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對不確定度為：

表1 移液器和容量瓶的相對不確定度

（3）校準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u(cal)。配制一系列質(zhì)量濃度的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.3.3的液相色譜條件進(jìn)行檢測。以丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（xi）為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的儀器響應(yīng)值（yi）為縱坐標(biāo)，采用線性最小二乘法擬合得到丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程為y=332.21x+1.34，相關(guān)系數(shù)r2=0.999。紙吸管試樣在相同測試條件下經(jīng)過2次平行測定，將獲得的儀器響應(yīng)值通過校準(zhǔn)曲線擬合即可得到浸泡液中丙烯酰胺的濃度，分別為0.024 mg/L和0.026 mg/L，則丙烯酰胺的平均濃度為0.025 mg/L。殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

式中：n為校準(zhǔn)曲線的濃度水平數(shù)；yi為校準(zhǔn)曲線各濃度的響應(yīng)值；y為由校準(zhǔn)曲線擬合的理論響應(yīng)值。

校準(zhǔn)曲線擬合試液中丙烯酰胺的濃度引入的不確定度為：

式中：b為校準(zhǔn)曲線的斜率；p為同一樣品測試溶液的測定次數(shù)；n為校準(zhǔn)曲線的濃度水平數(shù)；c為測試樣品溶液濃度的平均值，mg/L；xi為校準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的理論值，mg/L；x—為校準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的平均值，mg/L。部分參數(shù)的計(jì)算結(jié)果如表2所示。

表2 部分參數(shù)匯總表

其相對不確定度為：

（4）儀器的測量不確定度u(I)。丙烯酰胺遷移量測定采用的是液相色譜進(jìn)行定量分析，查詢該儀器校準(zhǔn)證書給出的擴(kuò)展不確定度為U(I)=5.2%，k=2，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

將以上4個(gè)不確定度分量進(jìn)行加權(quán)計(jì)算，得到測定浸泡液中丙烯酰胺濃度過程引入的相對不確定度：

2.2.4 加標(biāo)回收率引入的不確定度u(Rc)

由于測定浸泡液中丙烯酰胺的濃度存在回收率的問題，因此，為了考察回收率引入的不確定度，在10 mL的4%乙酸溶液（體積分?jǐn)?shù)）中添加濃度為10 mg/L的丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液30 μL，得到0.03 mg/L的加標(biāo)溶液，共制備6份。按照1.3所述方法進(jìn)行測定，測得6份加標(biāo)溶液中丙烯酰胺的加標(biāo)回收率分別為100.6%、98.7%、101.9%、107.8%、103.2%和105.1%，計(jì)算平均回收率為102.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差s(Rc)為2.217%。因此，回收率引入的相對不確定度為

2.2.5 平行樣品的重復(fù)測定引入的不確定度u(Rp)

從同批次的紙吸管中隨機(jī)抽取6個(gè)樣品，按照2.3進(jìn)行丙烯酰胺遷移量測定，結(jié)果分別為0.030 mg/L、0.028 mg/L、0.028 mg/L、0.030 mg/L、0.027 mg/L和0.028 mg/L，計(jì)算平均值為0.028 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)偏差s(Rp)為0.000 97 mg/L，則平行樣品的重復(fù)測定引入的相對不確定度為

2.2.6 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度

為了計(jì)算方便，將紙吸管中丙烯酰胺遷移量測定的各相對不確定度分量進(jìn)行匯總，如表3所示。由于各分量間相互獨(dú)立無關(guān)，因此合成相對不確定度為：

表3 不確定度分量匯總表

根據(jù)平行樣品重復(fù)測得樣品試液中丙烯酰胺的平均濃度為0.028 mg/L，按照公式（1）計(jì)算得到該批樣品的丙烯酰胺遷移量的均值X—為0.025 mg/kg，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(X)=X—×urel(X)=0.003 1 mg/kg。假設(shè)服從正態(tài)分布，95%的置信概率下取包含因子k為2，則丙烯酰胺遷移量測定結(jié)果的擴(kuò)展不確定度為u(X)=k×u(X)=0.006 2 mg/kg。

2.3 報(bào)告結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)測得紙吸管樣品的丙烯酰胺特定遷移量為0.025 mg/kg，測量不確定度報(bào)告結(jié)果為X=(0.025±0.006 2) mg/kg，k=2。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)不確定度來源及相對不確定度的計(jì)算評估可知，影響紙吸管的丙烯酰胺遷移量檢測結(jié)果的最主要因素為浸泡液中丙烯酰胺的濃度測定，而濃度測定過程中，校準(zhǔn)曲線擬合引入的相對不確定度最大。可能是由于丙烯酰胺遷移量測定采用的是液相色譜-紫外檢測法，丙烯酰胺的紫外吸收強(qiáng)度較低，可能存在低濃度水平時(shí)定量結(jié)果的偏差。因此，在實(shí)際檢測工作中，可通過增加校準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)的數(shù)量及進(jìn)樣次數(shù)改善擬合曲線的線性關(guān)系。同時(shí)，線性范圍不宜過大，上下限濃度值的差異盡量控制在20倍以內(nèi)，還要嚴(yán)格控制遷移試驗(yàn)溫度，以提高平行樣品間數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。