大蒜素對(duì)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面微循環(huán)的改善作用*

凌書建，楊麗萍，陶劍光，王小飛，蘇曉利，王杰

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056000

燒傷具有較高的致死率和致殘率，并且燒傷發(fā)病率高居外傷疾病譜第四位[1]。皮膚是最易受燒傷損害的體表組織，皮膚創(chuàng)面愈合是燒傷治療的關(guān)鍵，而燒傷后局部血液瘀滯、微血栓形成將導(dǎo)致創(chuàng)面組織進(jìn)行性壞死，從而增加治療難度并影響預(yù)后。因此，及時(shí)改善創(chuàng)面微循環(huán)以挽救瀕死細(xì)胞對(duì)提高燒傷治療預(yù)后意義重大[2-4]。大蒜素是天然存在的一種二烯丙基三硫化物，具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管等藥理學(xué)作用[5-7]，但大蒜素對(duì)燒傷創(chuàng)面組織微循環(huán)的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討大蒜素對(duì)燒傷創(chuàng)面微循環(huán)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物清潔級(jí)雄性Wistar大鼠150只，7周齡，體質(zhì)量210～240 g，購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004]；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開展實(shí)驗(yàn)[飼養(yǎng)環(huán)境：光照/黑暗12 h/12 h，溫度(25±1)℃]，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行,倫理批號(hào)：HDZXLL(K)字2020-007。

1.2 藥物與試劑大蒜素注射液(徐州萊恩藥業(yè)有限公司，規(guī)格：2 mL：30 mg，批號(hào)：20190224)；乳酸鈉林格注射液(石家莊四藥有限公司，批號(hào)：20191207)；可溶性血管細(xì)胞黏附分子1(soluble vascular cell adhesion molecule-1,sVCAM-1)、血管緊張素-Ⅱ(angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)、一氧化氮(nitric oxide,NO)檢測試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20190114、20190307、20190326)；兔抗鼠內(nèi)皮素1(endothelin-1,ET-1)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)、β-actin單克隆抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20181223、20181130、20190118)；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(美國Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：EB190217)；40 ng·L-1多聚甲醛、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：201911016、201904013)。

1.3 儀器YLS-5Q型燙傷儀(天津科技發(fā)展有限公司)；CUT4050型石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；LISCA型激光多普勒血液灌流成像儀(瑞典Perimed公司)；Allegra 21R型低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)；LBY-NJ型血小板聚集儀(北京普利生有限公司)；Tetra Systerm型電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 模型制備與給藥①深Ⅱ度燒傷大鼠模型的制備[8]：實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食禁水12 h，麻醉后剔除背部毛發(fā)并用硫化鈉溶液(8%)脫毛、75%乙醇消毒，假燒傷組大鼠立即腹腔注射給予5 mL乳酸鈉林格溶液以抗休克處理；其余各組通過燙傷儀(設(shè)置壓力0.03 MPa、溫度106 ℃、時(shí)間5 s)制備大鼠模型，通過病理學(xué)檢查判斷造模結(jié)局成功(見圖1，大部分真皮層內(nèi)細(xì)胞壞死，部分毛囊等附件殘存)，立即腹腔注射5 mL乳酸鈉林格溶液。②給藥：將模型制備成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組、大蒜注射液低、中、高劑量組(5 mg·kg-1、10 mg·kg-1、20 mg·kg-1)，每組30只，各組給予相應(yīng)藥物，假燒傷組和模型組給予同體積生理鹽水，療程14 d。

注：A：假燒傷組；B：模型組

2.2 創(chuàng)面情況肉眼觀察及組織病理學(xué)檢查①治療完成后，通過肉眼觀察創(chuàng)面情況，包括結(jié)痂狀況、分泌物、愈合狀況等方面變化；②各組隨機(jī)取10只大鼠并頸椎脫臼致死，取創(chuàng)面皮膚組織置40 ng·L-1多聚甲醛溶液72 h實(shí)施固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚度5 μm)、展片后行HE染色，然后梯度酒精脫蠟、二甲苯透明后封片，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察組織病理學(xué)改變。

2.3 創(chuàng)面愈合率的計(jì)算各組隨機(jī)取10只大鼠，于給藥前和給藥第14天后對(duì)皮膚燒傷創(chuàng)面進(jìn)行拍照，然后計(jì)算創(chuàng)面面積。

創(chuàng)面愈合率(%)=(1-未愈創(chuàng)面面積/初始創(chuàng)面面積)×100%

2.4 創(chuàng)面組織微循環(huán)血流灌注值(microcirculation perfusion valued,MPD)和含水量的測定[9]①通過激光多普勒血液灌流成像儀測定創(chuàng)面組織MPD值，室溫25 ℃，儀器參數(shù)設(shè)置：掃描速度100 ms/Line、掃描寬度64像素、輪廓50像素、視距12 cm、顯示頻率5 Hz，各掃描5次取平均值。②各大鼠經(jīng)頸椎脫臼致死，取創(chuàng)面組織稱其質(zhì)量(W1)，置95 ℃烤箱烘烤至恒重后稱質(zhì)量(W2)。

創(chuàng)面組織含水量(%)=(W1-W2)/W1×100%

2.5 血小板聚集率的測定取各組剩余10只大鼠，麻醉后，通過枸櫞酸鈉抗凝管經(jīng)腹主動(dòng)脈取全血，制備含血小板血漿和貧血小板血漿，調(diào)整其濃度為1.5×108mL-1，以ADP做為血小板聚集誘導(dǎo)劑，通過血小板聚集儀測定各組大鼠ADP誘導(dǎo)6 min時(shí)的血小板聚集率[10]。

2.6 血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量測定經(jīng)腹主動(dòng)脈取血(不抗凝)，離心取血清，然后按照ELISA試劑盒操作說明測定各組大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ含量，并采用硝酸還原酶法測定血清NO含量。

2.7 創(chuàng)面組織ET-1、NOS蛋白表達(dá)的測定將大鼠均頸椎脫臼致死后取創(chuàng)面皮膚組織，剪碎、加入9倍量4 ℃冷裂解液行研磨勻漿，低溫4 ℃離心(參數(shù)設(shè)置：12 000 rpm、15 min)取上清，BCA法測定總蛋白含量后，依次行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，滴加ET-1、NOS、β-actin單抗后 4 ℃ 孵育12 h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，37 ℃ 振蕩孵育1 h，PBS洗膜后滴加ECL顯色發(fā)光，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)獲得條帶灰度值；以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值半定量ET-1、NOS蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠燒傷創(chuàng)面情況一般情況假燒傷組大鼠創(chuàng)面皮膚正常、毛發(fā)長度已基本恢復(fù)；模型組大鼠皮膚創(chuàng)面壞死組織基本脫落，但新生肉芽較少、結(jié)痂厚度不均勻，仍有少量黃色液體滲出，毛發(fā)缺失；大蒜素低、中、高劑量組大鼠皮膚創(chuàng)面不同程度縮小，無滲出液，毛發(fā)開始生長，其中大蒜素高劑量組創(chuàng)面大部分結(jié)痂脫落、新愈合皮膚紅潤且彈性良好、毛發(fā)生長較為旺盛，其效果最為顯著。

3.2 各組大鼠燒傷創(chuàng)面組織病理學(xué)變化結(jié)果假燒傷組大鼠創(chuàng)面組織未見明顯異常；模型組大鼠創(chuàng)面組織可見真皮下層組織水腫，膠原纖維腫脹、斷裂炎性細(xì)胞浸潤等明顯的病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面組織可見白色皮粒形成、上皮組織排列整齊，汗腺和皮脂腺結(jié)構(gòu)完整、排列整齊但仍較表淺，炎性細(xì)胞浸潤明顯好轉(zhuǎn)；其中大蒜素高劑量組效果更為顯著。見圖2。

注：A：假燒傷組；B：模型組；C：大蒜素低劑量組；D：大蒜素中劑量組；E：大蒜素高劑量組

3.3 各組大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率比較與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組大鼠創(chuàng)面愈合率顯著升高(P<0.05；P<0.01)。見表1。

3.4 各組大鼠燒傷創(chuàng)面MPD和含水量比較與假燒傷組比較，模型組大鼠創(chuàng)面MPD顯著降低、含水量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組MPD顯著升高且含水量顯著降低(P<0.05；P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠燒傷創(chuàng)面愈合率、MPD和含水量比較

3.5 各組大鼠血小板聚集率比較與假燒傷組比較，模型組大鼠血小板聚集率顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組大鼠血小板聚集率顯著降低(P<0.05；P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血小板聚集率

3.6 各組大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量比較與假燒傷組比較，模型組大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量顯著降低(P<0.05；P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清sVCAM-1、Ang-Ⅱ、NO含量

3.7 各組大鼠燒傷創(chuàng)面組織ET-1、NOS蛋白表達(dá)比較與假燒傷組比較，模型組大鼠燒傷創(chuàng)面組織ET-1、NOS蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05；P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組ET-1表達(dá)量顯著下調(diào)而NOS蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)。見圖3、表4。

注：A：假燒傷組；B：模型組；C：大蒜素低劑量組；D：大蒜素中劑量組；E：大蒜素高劑量組

表4 各組大鼠燒傷創(chuàng)面組織ET-1、NOS蛋白表達(dá)量

4 討論

微循環(huán)障礙是燒傷所致的重要病理生理學(xué)改變，是導(dǎo)致燒傷創(chuàng)面加重而影響治療預(yù)后的重要因素，通過藥物改善微循環(huán)能夠明顯促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素能夠通過擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集等而促進(jìn)血液循環(huán)[14-15]。臨床上以深Ⅱ度燒傷最為常見，本實(shí)驗(yàn)制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型并給予大蒜素進(jìn)行治療。

血小板聚集是血小板的主要生理功能，黏附聚集于血管內(nèi)皮表面而縮窄血管腔，從而影響微循環(huán)，甚至血小板聚集是病理性血栓形成的核心環(huán)節(jié)[16-19]。血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)是介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附進(jìn)而誘導(dǎo)血栓形成的重要分子。研究發(fā)現(xiàn)，生理狀態(tài)下VCAM-1表達(dá)量較低，而在病理刺激下其表達(dá)上調(diào)，血清sVCAM-1含量與血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)正相關(guān)[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可降低改善燒傷大鼠血液血小板聚集的高凝狀態(tài)，改善燒傷創(chuàng)面微循環(huán)[22]；研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可改善大鼠燒傷創(chuàng)面微循環(huán)，有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合[23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療能夠顯著降低深Ⅱ度燒傷大鼠血小板聚集并抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附，這可能是大蒜素改善深Ⅱ度燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面局部微循環(huán)、促進(jìn)創(chuàng)面愈合的重要機(jī)制。

血管擴(kuò)張則有助于改善微循環(huán)。NO是內(nèi)皮細(xì)胞中L-精氨酸在NOS催化作用下產(chǎn)生的，具有血管擴(kuò)張的生理作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，Ang-Ⅱ是一種多功能活性肽，通過作用于血管平滑肌上的血管緊張素受體表現(xiàn)出較強(qiáng)的縮血管作用[25]。ET-1是體內(nèi)另一種強(qiáng)效血管收縮肽且在病理狀態(tài)下能夠促進(jìn)Ang-Ⅱ分泌[26-28]。研究發(fā)現(xiàn)，降低Ang-Ⅱ能夠有效改善燒傷創(chuàng)面微循環(huán)，進(jìn)而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[29]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療能夠顯著降低深Ⅱ度燒傷大鼠血清NO、Ang-Ⅱ含量，上調(diào)燒傷創(chuàng)面組織NOS表達(dá)并下調(diào)ET-1表達(dá)，提示大蒜素具有促進(jìn)創(chuàng)面血管擴(kuò)張的作用，可能是大蒜素改善深Ⅱ度燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面局部微循環(huán)的另一機(jī)制。

綜上所述，大蒜素能夠通過改善局部微循環(huán)而促進(jìn)大鼠深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合，其機(jī)制可能與降低血小板聚集、抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附、促進(jìn)血管擴(kuò)張有關(guān)。提示大蒜素能夠改善深Ⅱ度燒傷大鼠皮膚創(chuàng)面局部微循環(huán)并促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。