基于NF-κB/COX-2信號(hào)通路探討芍藥內(nèi)酯苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的影響*

黃梅，顏景穎

1.南方科技大學(xué)醫(yī)院，廣東 深圳 550002；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518111

潰瘍性結(jié)腸炎是一種腸道非特異性慢性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、便血等并伴隨著消瘦、發(fā)熱等癥狀[1]。我國(guó)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病率逐年上升[2]。由于潰瘍性結(jié)腸炎易反復(fù)發(fā)作，久治難愈，甚至需終生服藥的特點(diǎn)，使患者生活質(zhì)量嚴(yán)重下降。潰瘍性結(jié)腸炎常用治療藥物有氨基水楊酸制劑、抗生素、免疫抑制劑等，由于部分患者服用此類藥物仍存在病情反復(fù)發(fā)作，不易控制等情況[3]。因此，尋找新的藥物尤為重要。芍藥內(nèi)酯苷是白芍提取物之一，具有抗菌消炎、護(hù)肝等作用。研究表明，芍藥湯對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有一定的藥效作用[4]。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)/環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)信號(hào)通路在腸道炎癥過程中發(fā)揮重要作用[5]。因此，本研究旨在分析芍藥內(nèi)酯苷通過調(diào)控NF-κB/COX-2信號(hào)通路對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的影響，為芍藥內(nèi)酯苷的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物60只8周齡SPF級(jí)SD雄鼠，體質(zhì)量210～230 g，購(gòu)自上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2018-0006，溫度 22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照和黑暗各12 h，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲水。倫理批號(hào)：SUSTH20190302。

1.2 藥物與試劑芍藥內(nèi)酯苷(純度≥98%，南京道斯夫生物科技有限公司，批號(hào)：190412)；美沙拉嗪腸溶片(德國(guó)?？酥扑幑煞萦邢薰?，批號(hào)：H201207)。三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitro-Benzenesulfonic acid，TNBS)溶液(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1904182)；白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(武漢云克隆診斷試劑研究所有限公司，批號(hào)：R201905、R201903)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(上?？ㄅ锟萍加邢薰荆?hào)：190410A)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)試盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：201906C)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?，批號(hào)：201904136、201902115)；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)熒光染料預(yù)混劑(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號(hào)：PCR106321)；蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色試劑盒(上海羽朵生物科技有限公司，批號(hào)：190407004)；引物合成委托北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；NF-κB、COX-2、p-NF-κB、β-actin兔單克隆抗體和山羊抗兔辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：201905148、201906037、201906024、201907235、201908241)。

1.3 儀器H2100R型高速冷凍離心機(jī)(上海湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；Evolution350型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；HTY-761型勻漿儀(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)；LightCycler 96型 RT-qPCR儀(瑞士羅氏公司)；Tetra Cell制膠系統(tǒng)、轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；LAUDA型搖床(德國(guó)Varioshake公司)；BIOBASE-EL10A型酶標(biāo)儀(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司)；XSP-19C型光學(xué)顯微鏡(上海上光儀器有限公司)；YGQ-3126F型切片機(jī)、YT-7F型攤烤片機(jī)(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 模型制備與給藥60只SD雄鼠，隨機(jī)選取10只為假手術(shù)組，其余大鼠使用TNBS/乙醇混合液灌腸法建立潰瘍性結(jié)腸炎模型，具體如下：大鼠禁食不禁水 24 h，TNBS(80 mg·kg-1)與體積分?jǐn)?shù)50%無(wú)水乙醇按11混合。將大鼠麻醉后，使用硅膠軟管(直徑2 mm)插入大鼠肛門約8 cm深度，將 800 μL TNBS/乙醇混合液推入腸腔，倒置大鼠30 s，防止混合液外漏，待自然清醒后，正常飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠麻醉后向腸腔內(nèi)注射800 μL生理鹽水。3 d后，隨機(jī)挑取3只建模大鼠，取結(jié)腸組織經(jīng)過HE染色觀察結(jié)腸病變，出現(xiàn)出血、水腫、潰瘍即為建模成功。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、美沙拉嗪組(0.36 g·kg-1)、芍藥內(nèi)酯苷高劑量組(60 mg·kg-1)、芍藥內(nèi)酯苷中劑量組(30 mg·kg-1)、芍藥內(nèi)酯苷低劑量組(15 mg·kg-1)，各組給予相應(yīng)藥物14 d；假手術(shù)組和模型組均灌胃同體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。在造模期間死亡1只大鼠，然后分為假手術(shù)組10只、模型組9只、美沙拉嗪組9只、芍藥內(nèi)酯苷高劑量組10只、芍藥內(nèi)酯苷中劑量組9只，芍藥內(nèi)酯苷低劑量組9只。

2.2 ELISA法檢測(cè)大鼠血清促炎因子水平給藥結(jié)束后，將大鼠麻醉，輔助動(dòng)脈取血，室溫靜置2 h，3 000×g離心20 min，取上層清液即為血清，通過ELISA試劑盒檢測(cè)大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平。

2.3 檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織抗氧化指標(biāo)取血后，將大鼠頸椎脫臼法處死后，取出結(jié)腸，每只取同部位少許結(jié)腸，加生理鹽水，制備結(jié)腸組織勻漿。硫代巴比妥酸反應(yīng)法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中MDA活性；黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織中SOD活性。

2.4 HE染色觀察大鼠結(jié)腸組織病變每組隨機(jī)選取3只大鼠，取結(jié)腸組織置于40 ng·L-1多聚甲醛中固定過夜后，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，經(jīng)過脫蠟、復(fù)水后按照HE染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行切片HE染色，在顯微鏡下觀察其病理?yè)p傷變化。

2.5 RT-qPCR法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平每組隨機(jī)選取3只大鼠，取結(jié)腸組織，加入液氮研磨勻漿后，用RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，然后再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。NF-κB上游引物：5′-TAAGCATCGATTCCAGTAGAC-3′，下游引物：5′-TGATGCCATGCACTACGATA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度121 bp；COX-2上游引物：5′-CAGCTAGCCACATGATTCAC-3′，下游引物：5′-ATCTACAGATTCAGGATCGAT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度137 bp；β-actin上游引物：ATCTGACCGATACAGCATACG-3′，下游引物：5′-CTAGCTAGGCTAGCCCATAGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度115 bp。設(shè)置反應(yīng)程序：解鏈溫度95 ℃ 30 s，退火溫度56 ℃ 30 s，延伸溫度72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。使用配套熒光采集系統(tǒng)分析各樣本Ct值，計(jì)算出目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 Western Blot法檢測(cè)大鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表達(dá)每組隨機(jī)3只大鼠，取結(jié)腸組織，加入適量液氮研磨勻漿后，加入細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解過夜后，10 000×g離心 10 min，上清即為組織總蛋白，將蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，加入體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜，TBST緩沖液洗3次，更換二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，顯色。使用圖像分析軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算出目的蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠血清促炎因子水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷高劑量組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平極顯著降低(P<0.01)，芍藥內(nèi)酯苷中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α水平比較

3.2 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠結(jié)腸抗氧化指標(biāo)活性的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織MDA活性顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織MDA活性顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸MDA、SOD活性比較

3.3 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響假手術(shù)組大鼠結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列整齊，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠結(jié)腸黏膜多處潰爛、壞死，腺體排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重；芍藥內(nèi)酯苷高劑量組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)基本完整，腺體排列整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；美沙拉嗪組和芍藥內(nèi)酯苷中劑量組大鼠結(jié)腸黏膜上皮較完整，腺體排列較整齊，有少量炎性浸潤(rùn)；芍藥內(nèi)酯苷低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜充血水腫偶見潰瘍，腺體排列稀疏且不規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。見圖1。

3.4 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠結(jié)腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠大鼠結(jié)腸組織NF-κBmRNA、COX-2mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB mRNA、COX-2 mRNA表達(dá)比較

3.5 芍藥內(nèi)酯苷對(duì)大鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 大鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2蛋白及p-NF-κB表達(dá)

表4 各組大鼠結(jié)腸組織NF-κB、COX-2及p-NF-κB蛋白表達(dá)比較

4 討論

潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制尚未明確，遺傳、免疫低下、腸道微生態(tài)失衡等均是其致病因素[6-7]。多種因素相互作用引起機(jī)體免疫反應(yīng)被激活，炎性因子釋放，造成腸道發(fā)生持續(xù)性炎癥，嚴(yán)重影響腸道的功能，損壞腸道黏膜屏障[8-9]，使得細(xì)胞通透性增加，導(dǎo)致腸黏膜遭受細(xì)菌、內(nèi)毒素等侵害，發(fā)生糜爛、潰瘍等[10]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，潰瘍性結(jié)腸炎主要由大腸濕熱、肝血虧虛所致，治療以補(bǔ)虛瀉實(shí)、清熱利濕、理氣導(dǎo)滯為主[11-12]。芍藥具有清熱涼血、補(bǔ)血柔肝、散瘀止痛等功效[13-14]，芍藥內(nèi)酯苷是其主要的有效成分之一，研究芍藥內(nèi)酯苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療效果具有重要臨床意義。

IL-1β是引起潰瘍性結(jié)腸炎的促炎因子之一，可促使炎性細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，活化淋巴細(xì)胞等作用[15]。研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎患者在潰瘍活動(dòng)期結(jié)腸中IL-1β水平升高[16]。IL-1β已作為臨床判斷潰瘍結(jié)腸炎的潰瘍程度與療效的重要指標(biāo)之一。TNF-α是一種重要的促炎因子，已證實(shí)與潰瘍性結(jié)腸癌發(fā)病有關(guān)[17]。正常生理狀態(tài)下，TNF-α具有抗感染、促進(jìn)組織修復(fù)等作用，在病理狀態(tài)下，會(huì)刺激機(jī)體局部組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[18-19]。研究報(bào)道，TNF-α可改變腸道黏膜通透性，導(dǎo)致腸道損傷，且隨著腸道損傷程度加重，TNF-α水平也隨之升高[20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷組大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平顯著降低，提示芍藥內(nèi)酯苷可以抑制炎癥反應(yīng)。

研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎局部炎癥反應(yīng)與氧自由基密切相關(guān)，機(jī)體氧自由基可激活或者充當(dāng)炎性介質(zhì)，引起結(jié)腸組織發(fā)生炎癥反應(yīng)[21]。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，氧自由基可與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可被機(jī)體代謝分解為MDA，MDA可使組織中蛋白質(zhì)變性、生物膜結(jié)構(gòu)受損，引起促炎因子釋放，導(dǎo)致組織損傷加重[22]。SOD為抗氧化酶，可清除氧自由基，抑制組織中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎患者血清、腸黏膜中MDA升高而SOD降低[23]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織MDA活性顯著降低，SOD活性顯著升高。

NF-κB通路與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí)，促炎因子IL-1β、TNF-α等可激活NF-κB，使其發(fā)生磷酸化，激活 NF-κB 通路，促使IL-1β、TNF-α的進(jìn)一步表達(dá)，發(fā)生炎癥反應(yīng)[24-26]。研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸病變組織NF-κB異常高表達(dá)[27]。COX-2在正常組織中表達(dá)極低，在炎癥、腫瘤等病理狀態(tài)下其表達(dá)顯著增加[28]。COX-2可使炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量前列腺素E2、白三烯等炎癥介導(dǎo)物質(zhì)，導(dǎo)致炎癥部位出現(xiàn)紅、腫、熱、痛，從而加重腸道潰瘍[29-30]。本研究結(jié)果顯示，模型組比較，芍藥內(nèi)酯苷高、中、低劑量組及美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織p-NF-κB/NF-κB水平及COX-2蛋白表達(dá)顯著降低，提示芍藥內(nèi)酯苷對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用可能與NF-κB/COX-2信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，芍藥內(nèi)酯苷可抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的炎癥反應(yīng)，抑制結(jié)腸組織過氧化反應(yīng)，減輕結(jié)腸組織病變，作用可能與NF-κB/COX-2信號(hào)通路有關(guān)。