亞低溫對(duì)急性心肌梗死SD大鼠心肌保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究

高仁俊　　王顯艷　　張?chǎng)稳铩　⌒ふ虏　堷P嬌　　蔡彧　　趙紅曄　　李懿桐　　宗浩　　王艷麗

[摘要] 目的 實(shí)驗(yàn)觀察誘導(dǎo)亞低溫（32℃～36℃）治療對(duì)SD大鼠急性心肌梗死后心肌的保護(hù)。 方法 40只健康SD大鼠隨機(jī)分為兩組，即常溫對(duì)照組和誘導(dǎo)亞低溫實(shí)驗(yàn)組，建立急性心肌梗死（AMI）實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，結(jié)扎左前降支近端，結(jié)扎后1 h后再解除結(jié)扎，4 h后分別測(cè)定兩組大鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、心率（HR）和左室舒張末期壓（LVEDP）、心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平及TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果 亞低溫組治療后LVEF、SOD水平明顯高于常溫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;亞低溫組治療后HR、LVEDP、MDA水平、心肌細(xì)胞凋亡率均明顯低于常溫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論? 亞低溫治療通過(guò)降低心室率，提高左心室射血分?jǐn)?shù)，改善左室舒張末期壓以及降低心肌的氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡率，來(lái)保護(hù)左心室心功能，從而達(dá)到對(duì)急性心肌梗死的缺血/再灌注心肌的保護(hù)，最終降低病死率。

[關(guān)鍵詞] 急性心肌梗死;亞低溫;心功能;氧化應(yīng)激損傷;細(xì)胞凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R541.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）09-0030-04

Experimental study on mild hypothermia on myocardial protection in SD rats with acute myocardial infarction

GAO Renjun1? WANG Xianyan2? ZHANG Xinrui1? XIAO Zhangbo3? ZHANG Fengjiao1? CAI Yu1? ZHAO Hongye4? LI Yitong1? ?ZONG Hao1? ?WANG Yanli1

1.Sixth Department of Cardiology， Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar 161006，China;2.Department of Pathology， Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China;3.Department of Scientific Research， Second Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China;4. Department of Physiology， Qiqihar Medical University， Qiqihar? ?161006，China

[Abstract] Objective? ?To observe the myocardial protection of induced mild hypothermia （32℃～36℃） in SD rats with acute myocardial infarction through experiment. Methods? A total of 40 healthy SD rats were randomly divided into two groups as the normal temperature control group and the induced mild hypothermia experimental group. An acute myocardial infarction （AMI） experimental model was established. The proximal left anterior descending artery was ligated and then released 1 hour after ligation. After 4 hours， the left ventricular ejection fraction （LVEF）， heart rate （HR）， left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）， superoxide dismutase （SOD） level， and malondialdehyde （MDA） level were detected in the two groups. TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis rate. Results? After treatment， the levels of LVEF and SOD in the mild hypothermia group were significantly higher than those in the normal temperature group， with statistically significant differences （P<0.05）. After treatment， the levels of HR， LVEDP， MDA， and the myocardial cell apoptosis rate in the mild hypothermia group were significantly lower than those in the normal temperature group， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion? Mild hypothermia therapy protects left ventricular function by decreasing HR， increasing LVEF， improving LVEDP， and reducing myocardial oxidative stress damage and cell apoptosis rate， to protect ischemia/reperfusion myocardium after acute myocardial infarction， to ultimately reduce mortality rate.

[Key words] Acute myocardial infarction; Mild hypothermia; Cardiac function; Oxidative stress injury; Apoptosis

目前，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）致死、致殘率仍排在心血管疾病的首位，盡最大可能快速開(kāi)通閉塞冠脈是治療的關(guān)鍵。多方證實(shí)已在此過(guò)程中的心肌缺血/再灌注損傷會(huì)引起心肌頓抑、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，最終影響患者病死率、心臟功能及預(yù)后。因此，如何減輕心臟負(fù)荷、干預(yù)氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕炎性反應(yīng)和減少細(xì)胞凋亡等顯得尤為重要。多年來(lái)，科研工作者及臨床工作者均在探索可以減輕心肌缺血/再灌注損傷的方法。

目前，已證實(shí)亞低溫在減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、心功能等方面對(duì)心肺復(fù)蘇、腦組織、腎臟組織等起到保護(hù)作用。且有研究證明對(duì)急性梗死心肌進(jìn)行治療時(shí)可同時(shí)干預(yù)心功能和氧化應(yīng)激反應(yīng)[1-4]。

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)制備SD大鼠急性心肌梗死模型，將左前降支急性閉塞1 h后，再打開(kāi)結(jié)扎進(jìn)行再灌注，達(dá)到心肌缺血/再灌注損傷狀態(tài)，觀察4 h后，以左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、心率（heart rate，HR）和左室舒張末期壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、心肌組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平及TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率為觀察指標(biāo)，探討亞低溫對(duì)缺血/再灌注心肌組織的心功能、氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡的影響，從而得出亞低溫治療可以保護(hù)急性缺血/再灌注心肌的結(jié)論。現(xiàn)將所得結(jié)果報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由黑龍江省齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（黑） 2018-001。所有的動(dòng)物處置均嚴(yán)格遵守國(guó)際倫理標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求執(zhí)行，并已順利通過(guò)齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)嚴(yán)格審議。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20190506）、丙二醛（MDA）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20190308）、TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)實(shí)驗(yàn)試劑盒（生產(chǎn)批號(hào)：20190602）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，DW-3000C型小動(dòng)物有氧呼吸機(jī)購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技產(chǎn)業(yè)發(fā)展股份有限責(zé)任公司。

1.3動(dòng)物分組與造模

40只SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為A組（亞低溫治療組）和B組（常溫對(duì)照組），每組各20只。

急性心肌梗死模型的建立：兩組大鼠均持續(xù)監(jiān)測(cè)直腸溫度4 h，其中給予誘導(dǎo)亞低溫的每只大鼠最低有效劑量的苯巴比妥鈉，以防止發(fā)抖。麻醉大鼠后，直視下氣管插管術(shù)，所有大鼠均采用正壓呼吸機(jī)通氣[潮氣量70～80 ml，呼吸頻率（12～14）次/min，吸呼比2∶1]。在第4肋間行左胸垂直切口，打開(kāi)心包露出心臟。心臟在閉塞前滴入0.5%的利多卡因。左前降支開(kāi)口以遠(yuǎn)約2 mm處用5-0縫線結(jié)扎，用心電圖觀察術(shù)前、術(shù)后肢體導(dǎo)聯(lián)ST段的變化，以ST段弓背向上抬高來(lái)確定手術(shù)成功，維持1 h后解開(kāi)結(jié)扎，使心肌再灌注，關(guān)胸，全程心電圖監(jiān)測(cè)，并保存。

造模成功后，常溫組大鼠給予尾靜脈注射一定量的常溫生理鹽水1.0 ml/（min·kg），并置于毯子中，保持體溫（36℃～38℃）;亞低溫大鼠則可通過(guò)尾靜脈輸送4 ℃生理鹽水1.0 ml/（min·kg），誘導(dǎo)亞低溫狀態(tài)，持續(xù)肛溫測(cè)量，維持肛溫32℃～36℃。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心功能指標(biāo)的測(cè)定? 使用 Vevo770 型號(hào)超聲儀（Visualsonics Inc，Canada），用17.5 MHz探頭，采用M模塊采集LVEF、HR和LVEDP數(shù)值，分別測(cè)出常溫組及亞低溫組3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.4.2 SOD、MDA檢測(cè)方法? 留取每只大鼠左心室心尖部的心肌，以冰生理鹽水進(jìn)行沖洗，經(jīng)差速離心法提取心肌勻漿蛋白，分別用于檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)SOD、MDA的含量。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4.3心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法? 實(shí)驗(yàn)方法具體采用TUNEL法，自結(jié)扎線下0.5 cm 處切取一小塊心肌組織，將其置入10%多聚甲醛固定，24 h后行常規(guī)石蠟包埋、切片，貼附于其表面涂有多聚賴氨酸的載玻片上，檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率。按檢驗(yàn)試劑包裝盒的使用說(shuō)明書(shū)規(guī)定執(zhí)行。

于光鏡下進(jìn)行觀察每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)部含有綠色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。每張細(xì)胞切片隨機(jī)分別選取5個(gè)視野（×200），算出凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞的視野數(shù)量，得出AI。AI=視野中凋亡細(xì)胞數(shù)量/視野中細(xì)胞總數(shù)量×100%。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用One Way ANOVA對(duì)兩組間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠左心功能指標(biāo)變化情況比較

亞低溫治療組左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）明顯高于常溫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而亞低溫治療組的心率（HR）和左室舒張末期壓（LVEDP）明顯低于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1? ?兩組SD大鼠左心功能變化情況比較（x±s，n=20）

2.2兩組大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)比較

亞低溫治療組心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）明顯高于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;亞低溫治療組丙二醛（MDA）明顯低于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2? ?兩組大鼠氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)比較（x±s，n=20）

2.3兩組大鼠心肌細(xì)胞平均凋亡率變化比較

亞低溫治療組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率為（17.63±1.98）%，明顯低于常溫對(duì)照組（28.86±2.97）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.08，P<0.001）（圖1）。

3 討論

急性心肌梗死的搶救要求盡早開(kāi)通閉塞冠脈，但是搶救過(guò)程中的缺血/再灌注損傷在所難免，所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、心肌頓抑、心肌細(xì)胞凋亡以及左心功能下降[4-5]，是影響病死率和預(yù)后的本質(zhì)。大量文獻(xiàn)證實(shí)，亞低溫對(duì)機(jī)體組織的缺血/再灌注的保護(hù)作用已經(jīng)在臨床中被廣泛應(yīng)用[6-9]，如大面積腦梗死患者，經(jīng)過(guò)溶栓或介入方法使腦血管再通，即可出現(xiàn)腦組織的缺血/再灌注損傷，亞低溫治療聯(lián)合呋塞米可以達(dá)到腦保護(hù)的效果。而對(duì)于心臟驟停的患者，同樣涉及到各個(gè)重要臟器的缺血/再灌注損傷，有研究中針對(duì)心臟驟停患者應(yīng)用亞低溫治療，觀察復(fù)蘇后心肌、腎臟、肺臟等功能恢復(fù)情況及損傷程度評(píng)估，發(fā)現(xiàn)亞低溫治療確能對(duì)人體重要臟器發(fā)揮保護(hù)作用。吸取大量的應(yīng)用亞低溫治療的臨床和實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，在本研究中針對(duì)亞低溫對(duì)急性梗死心肌的保護(hù)機(jī)制進(jìn)行觀察，以心率、左室舒張末期壓、左心室收縮功能、心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)以及心肌細(xì)胞凋亡率為觀察指標(biāo)，探討亞低溫在急性心肌梗死治療中對(duì)心肌的保護(hù)效果。

目前，氧化應(yīng)激代謝激活被廣泛公認(rèn)是一種大腦神經(jīng)組織缺血后功能恢復(fù)或出現(xiàn)大量血液供給后的腦損傷的主要代謝機(jī)制[10-11]，MDA是一種氧化應(yīng)激代謝反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，具有細(xì)胞毒性，其含量能反映氧化應(yīng)激程度。超氧化物歧化酶（SOD）也可以通過(guò)直接參與對(duì)氧自由基的激活清除，拮抗氧化應(yīng)激，測(cè)量二者水平可間接觀察機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的細(xì)胞損傷程度[12]。另外，在缺血、缺氧及再灌注過(guò)程中心肌細(xì)胞不僅出現(xiàn)大量的氧化應(yīng)激損傷，還可能會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡[13-14]，主要位于心肌梗死邊緣地帶。而心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞凋亡直接影響預(yù)后和心功能。所以，在本次誘導(dǎo)亞低溫治療急性心肌梗死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，將心率（HR）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、細(xì)胞凋亡率設(shè)定為兩組SD大鼠急性心肌梗死治療中的重要觀察指標(biāo)，結(jié)果顯示亞低溫治療組LVEF明顯高于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明亞低溫治療可以改善急性心肌梗死大鼠的左室心功能。而HR、LVEDP均明顯低于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明亞低溫治療可以降低心室率，阻止交感神經(jīng)興奮的代償反應(yīng)，從而降低心肌耗氧量，并改善左室舒張末期壓力。亞低溫治療組SOD（U/L）明顯高于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且MDA（mmol/L）明顯低于常溫對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明亞低溫治療組相比對(duì)照組有更強(qiáng)的氧自由基的激活清除能力和拮抗氧化應(yīng)激的能力;氧化應(yīng)激代謝反應(yīng)的最終代謝產(chǎn)物MDA值低于對(duì)照組，說(shuō)明亞低溫治療相比對(duì)照組可以減少氧化應(yīng)激損傷的最終代謝產(chǎn)物生成。另外，本項(xiàng)研究結(jié)果中證實(shí)亞低溫組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說(shuō)明亞低溫治療方法可以有效干預(yù)急性心肌梗死的缺血/再灌注心肌細(xì)胞的凋亡率。

綜上所述，在SD大鼠的急性心肌梗死治療中應(yīng)用亞低溫技術(shù)，可以降低心室率及左室舒張末期壓力，提高左室射血分?jǐn)?shù)，降低氧化應(yīng)激損傷及心肌細(xì)胞凋亡的幾率，以改善心肌梗死后心功能和預(yù)后。從而證實(shí)亞低溫治療可以對(duì)急性心肌梗死后的心肌產(chǎn)生明顯的防御保護(hù)作用，且此種治療措施簡(jiǎn)單易行，容易在臨床中推廣應(yīng)用。

另外，缺血/再灌注可以引起線粒體微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，而線粒體是真核細(xì)胞氧化磷酸化產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的重要場(chǎng)所，主要承擔(dān)著調(diào)控細(xì)胞能量代謝和凋亡通路的任務(wù)，同樣，心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)可以引起心肌細(xì)胞的損傷，甚至心肌細(xì)胞凋亡。下一步將進(jìn)行亞低溫治療對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響，以及亞低溫與心肌細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路及相關(guān)凋亡蛋白的關(guān)系。本項(xiàng)研究為其打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終期望能阻止心肌細(xì)胞缺血/再灌注的損傷通路，使急性心肌梗死患者獲益，為臨床急性心肌梗死患者的治療提供更多的、科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? ?陳凱，湯展陳，湯展宏.亞低溫對(duì)脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響[J].醫(yī)藥界，2020，（5）：137.

[2]? ?呂英俊，余平，陳驊.燈盞花素對(duì)急性心肌梗死大鼠心功能及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的影響[J].新中醫(yī)，2021，53（4）：10-15.

[3]? ?尤勇，張北源，陳顯成，等.恒定亞低溫對(duì)豬體外心肺復(fù)蘇后的腎保護(hù)作用[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2019，32（11）：1140-1144.

[4]? ?吳志殿，謝承志，黎金國(guó)，等.亞低溫聯(lián)合氯丙嗪對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2020，18（24）：4158-4160.

[5]? ?賈茹，祝慧慧，侯廣玉，等.心肌梗死大鼠模型制備方法的研究[J].中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2019，11（7）：159-161.

[6]? ?戴崇亮，胡琳琳，李立，等.局部亞低溫聯(lián)合呋塞米治療急性大面積腦梗死療效觀察[J].海南醫(yī)學(xué)，2019，30（20）：2622-2625.

[7]? ?解毅，許傳凱，饒璐.亞低溫腦保護(hù)對(duì)重型創(chuàng)傷性顱腦損傷患者預(yù)后的影響[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2020，58（28）：18-21.

[8]? ?林振田，何麗珠，何桂蘭，等.亞低溫治療心肺復(fù)蘇成功患者對(duì)免疫功能、肺功能的影響分析[J].中國(guó)處方藥，2019，17（12）：171-172.

[9]? ?李國(guó)吾，武玉榮，鄒俊，等.亞低溫治療對(duì)心肺復(fù)蘇術(shù)后腦復(fù)蘇的影響[J].中國(guó)急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志，2019， 14（2）：193-194.

[10]? 馬軍輝.長(zhǎng)時(shí)程亞低溫療法對(duì)重型顱腦損傷患者術(shù)后凝血功能、氧化應(yīng)激損傷和炎性因子水平的影響[J].河南外科學(xué)雜志，2019，25（2）：5-7.

[11]? Feng Zhou，Maode Wang，Jing Ju，et al.Schizandrin A protects against cerebral ischemia-reperfusion injury by suppressing inflammation and oxidative stress and reg-ulating the AMPK/Nrf2 pathway regulation[J].Am J Transl Res， 2019，11 （1）：199-209.

[12]? 孫瑾，吳瑞杰，朱軍，等.靜脈應(yīng)用rt-PA聯(lián)合亞低溫治療對(duì)急性腦梗死患者NIHSS評(píng)分、顱內(nèi)壓和血清SOD、MDA水平的影響[J].卒中與神經(jīng)疾病，2018，25（4）：381-384.

[13]? 胡陽(yáng)，鄧潔，王婷婷，等.運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2020，40（2）：379-383.

[14]? 余麗霞，王鍵.miRNA調(diào)控心肌梗死后心肌細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].心臟雜志，2019，31（2）： 227-231.

[15]? 陸宗慶，朱星星，賈迪，等.血管內(nèi)降溫相較體表降溫對(duì)心臟驟?；颊哳A(yù)后影響的Meta分析[J].中國(guó)詢證醫(yī)學(xué)雜志，2020，20（2）：160-167.

（收稿日期：2021-11-06）