溶血標(biāo)本對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HIV抗體檢驗(yàn)結(jié)果的影響

張婷婷

[摘要] 目的? 研究血標(biāo)本在應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HIV抗體時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。方法 自我院體檢中心2020年1-12月間接受健康體檢的人群中選出100名志愿者，均采集外周靜脈血標(biāo)本，將標(biāo)本分成4份，1份為正常合格標(biāo)本（未溶血組），將血液標(biāo)本人工溶血成游離血紅蛋白<60 mmol/L（輕度溶血組）、（60～110） mmol/L（中度溶血組）、>110 mmol/L（重度溶血組），采用酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法對(duì)四組標(biāo)本進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)，對(duì)比吸光度A值和化學(xué)發(fā)光值（RLU）。結(jié)果 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的血液標(biāo)本，隨著溶血程度的提高，吸光度A值也明顯提高（P<0.05）;其中中度溶血組和重度溶血組的吸光度A值明顯高于未溶血組（P<0.05）;中度溶血組有2例假陽(yáng)性，重度溶血組有6例假陽(yáng)性。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)的血液標(biāo)本中：未溶血組的RLU值與輕度、中度、重度溶血組的RLU值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且輕度溶血組和中度溶血組均無(wú)假陽(yáng)性，僅重度溶血組有1例假陽(yáng)性。結(jié)論 在HIV抗體檢測(cè)中：溶血標(biāo)本對(duì)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的結(jié)果影響較大，對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)的結(jié)果影響較小，但是隨著溶血程度的加重，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此需加強(qiáng)檢驗(yàn)前質(zhì)量控制，保證標(biāo)本的合格。

[關(guān)鍵詞] 溶血標(biāo)本;HIV抗體;化學(xué)發(fā)光免疫分析法;酶聯(lián)免疫吸附法;假陽(yáng)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）08-0107-04

Effect of blood specimens on the detection results of HIV antibodies by chemiluminescent immunoassay

ZHANG Tingting

Clinical Laboratory Center， Affiliated Hospital of Liaoning University of Chinese Medicine， Shenyang? ?110032， China

[Abstract] Objective To study the effect of blood specimens on the detection results of HIV antibodies by chemiluminescent immunoassay （CLIA）. Methods A total of 100 volunteers were selected from the population undergoing health examination in our physical examination center from January 2020 to December 2020， and peripheral venous blood specimens were collected from these volunteers. The specimens were divided into four groups， which were respectively the normal qualified specimens （non-hemolyzed group）， free hemoglobin < 60 mmol/L （mildly hemolyzed group）， free hemoglobin in the range of 60～110 mmol/L （moderately hemolyzed group）， and free hemoglobin > 110 mmol/L （severely hemolyzed group） from the blood specimens that were artificially hemolyzed. The four groups of specimens were detected for HIV antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and CLIA， and the absorbance （A values） and chemiluminescence values （relative light unit， RLU） were compared between the four groups. Results The A values of the blood specimens detected by ELISA increased significantly with the increase of the degree of hemolysis （P<0.05）. The A values of the moderately hemolyzed group and the severely hemolyzed group were significantly higher than those of the non-hemolyzed group （P<0.05）. There were two pseudo positives in the moderately hemolyzed group and six pseudo positives in the severely hemolyzed group. In the blood specimens detected by CLIA， there were no statistically significant differences between the RLU values of the non-hemolyzed group and those of the mildly， moderately and severely hemolyzed groups （P>0.05）. In addition， there were no pseudo positives in the mildly and moderately hemolyzed groups， and there was only one pseudo positive case in the severely hemolyzed group. Conclusion In the detection of HIV antibodies， hemolyzed specimens have a greater impact on the results of ELISA and a smaller impact on the results of CLIA. However， as the degree of hemolysis increases， pseudo positives may also occur in CLIA. Therefore， it is necessary to strengthen pre-detection quality control to ensure that the specimens are qualified.

[Key words] Hemolyzed specimens; HIV antibodies; Chemiluminescent immunoassay; Enzyme-linked immunosorbent assay; Pseudo positive

艾滋病是常見(jiàn)的一種傳染性疾病，其經(jīng)血液、性交、靜脈吸毒等途徑傳播，該病可破壞人體的免疫功能，導(dǎo)致反復(fù)感染，難以治愈[1-2]，艾滋病嚴(yán)重威脅著人們的生命健康[3]。在我國(guó)，艾滋病的疫情流行狀況大致是從高危人群向普通人群擴(kuò)散，從局部向整體擴(kuò)散。當(dāng)前尚無(wú)治療HIV的特效藥物以及預(yù)防疫苗，因此加強(qiáng)對(duì)艾滋病的篩查，控制傳染源，切斷傳播途徑就顯得尤為重要[4-5]。檢測(cè)血清中的HIV抗體是臨床上診斷艾滋病的主要依據(jù)，而不同的檢測(cè)方法的結(jié)果可能存在一定差異，酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法是目前最常用的兩種方法，其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法具有自動(dòng)化程度、靈敏度和特異度高的特點(diǎn)[6]，正在逐漸取代酶聯(lián)免疫吸附法。但在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)工作中發(fā)現(xiàn)，溶血會(huì)對(duì)多種檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。本文特探討溶血對(duì)HIV檢測(cè)結(jié)果的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

自我院體檢中心2020年1-12月接受健康體檢的人群中選出100名志愿者，納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）未感染HIV病毒。（2）年齡18～89歲，性別不限。（3）自愿參與本研究，簽署知情同意書(shū)。排出標(biāo)準(zhǔn)[8]：（1）合并先天性疾病、重要臟器功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病等患者。（2）合并其他傳染疾病者。（3）合并認(rèn)知交流障礙、精神疾病者。（4）臨床資料不完整者。本組100例志愿者中：男47例，女53例，年齡23～78歲，平均（42.9±11.3）歲;BMI指數(shù)為（17.3～25.6） kg/m2，平均（21.9±1.0）kg/m2。100例志愿者均在相同條件下采集4份標(biāo)本，將標(biāo)本分成未溶血組、輕度溶血組、中度溶血組和重度溶血組，四組標(biāo)本的一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

（1）ELISA法檢測(cè)應(yīng)用的儀器與試劑為BIO-RAD 680酶標(biāo)儀、MINDRAY MW-12A洗板機(jī)，同時(shí)由萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供配套的ELISA法HIV抗體診斷試劑盒。化學(xué)發(fā)光免疫分析法應(yīng)用的儀器與試劑為L(zhǎng)IAISON XL發(fā)光儀及配套試劑（由SORIN公司提供）。（2）具體方法：100名志愿者均采集肘正中靜脈血10 ml到離心管中，分成4份，1份為肉眼無(wú)可見(jiàn)的溶血、脂血、黃疸的正常合格標(biāo)本，設(shè)為未溶血組（n=100），待血液凝固后，將凝固后的血液標(biāo)本置于離心機(jī)上以4000 r/min的速度離心10 min左右，然后取上層血清。其余3份標(biāo)本則采用物理振蕩和反復(fù)凍融的物理方法進(jìn)行人工溶血，然后分離血清，采用鄰里氨甲苯胺法測(cè)定游離血紅蛋白，確定標(biāo)本的溶血程度，分別為游離血紅蛋白<60 mmol/L（輕度溶血組，n=100）、（60～110） mmol/L（中度溶血組，n=100）、>110 mmol/L（重度溶血組，n=100）。對(duì)4組血液標(biāo)本進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)，分別采用酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)，按照儀器的操作說(shuō)明手冊(cè)、配套試劑的使用說(shuō)明書(shū)等規(guī)范檢測(cè)，為保證檢測(cè)結(jié)果的可比性，檢測(cè)時(shí)保證在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，檢測(cè)的試劑采用同一批次。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)比同一標(biāo)本在溶血前后的吸光度A值和化學(xué)發(fā)光值（RLU），其中化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)的判斷標(biāo)準(zhǔn)是：當(dāng)化學(xué)發(fā)光值≥臨界值（CO）時(shí)判定為陽(yáng)性;ELISA法的判斷標(biāo)準(zhǔn)：吸光度A值≥臨界值時(shí)判定為陽(yáng)性[9]。初篩為陽(yáng)性者需重新采集標(biāo)本復(fù)檢，若仍為陽(yáng)性，則需送疾控中心用免疫印跡法認(rèn)證。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS24.0軟件檢驗(yàn)數(shù)據(jù)資料，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)， P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果

見(jiàn)表1所示，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的標(biāo)本，隨著溶血程度的提高，吸光度A值也明顯提高（P<0.05）;其中中度溶血組與重度溶血組的吸光度A值明顯高于未溶血組（P<0.05）。在化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)中：未溶血組與不同程度溶血組的RLU值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 四組的陽(yáng)性率比較

見(jiàn)表2所示，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的標(biāo)本，其中中度溶血組有2例假陽(yáng)性，重度溶血組有6例假陽(yáng)性;而化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)僅重度溶血組有1例假陽(yáng)性。

3 討論

3.1 艾滋病的流行特點(diǎn)概述

艾滋?。ˋIDS）是危及人類(lèi)生命健康的一類(lèi)傳染疾病，是目前在全球內(nèi)流行的一種傳染病。近40年來(lái)，全球每年因艾滋病致死的人數(shù)就在2500萬(wàn)以上。在我國(guó)，1985年首例艾滋病病例被報(bào)道，此后艾滋病病例逐漸增多。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示：近年來(lái)我國(guó)的艾滋病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，在地域分布上呈西高東低、南高北低的趨勢(shì)，部分地區(qū)高低波動(dòng)，西南地區(qū)、新疆是艾滋病的高發(fā)地區(qū)。目前臨床上尚無(wú)特效藥物治療，而且在性解放、人口流動(dòng)大、毒品交易、同性戀等泛濫的社會(huì)環(huán)境中，HIV感染疫情嚴(yán)重。由于艾滋病的潛伏期長(zhǎng)，初期HIV感染者無(wú)明顯癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)，繼而可通過(guò)血液、性交等方式傳播給他人，造成艾滋病的泛濫。因此，加強(qiáng)對(duì)普通人群的HIV抗體檢測(cè)，及時(shí)篩查出HIV感染或AIDS患者，對(duì)于控制傳染源、切斷傳播途徑具有重要意義。

3.2 HIV抗體檢測(cè)的兩種方法

而HIV感染的診斷鑒別是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)呐R床工作，其診斷結(jié)果需要高度精確。目前以HIV抗體檢測(cè)為主，不同的檢測(cè)方法、檢測(cè)試劑等均可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確，造成假陽(yáng)性。（1）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是檢測(cè)HIV抗體的常用方法之一，但是其操作流程相對(duì)繁瑣，一般需1～2 h才能出檢測(cè)結(jié)果，耗時(shí)長(zhǎng)。操作過(guò)程中的反復(fù)加氧和洗板等操作增加了結(jié)果的誤差[10-11]，對(duì)于HIV濃度低的標(biāo)本，應(yīng)用該法檢測(cè)的靈敏度偏低，易出現(xiàn)假陰性。尤其是溶血標(biāo)本對(duì)ELISA檢測(cè)結(jié)果的影響較大，這主要是因?yàn)橛坞x血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶活性，其與辣根過(guò)氧化物酶作用相似，在ELISA檢測(cè)中可催化底物顯色，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。（2）化學(xué)發(fā)光免疫分析法于20世紀(jì)90年代被引入到HIV抗體檢測(cè)中，該方法是將化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光體系與免疫反應(yīng)結(jié)合起來(lái)的一種技術(shù)，被用于檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)，其工作原理與放射免疫、酶免疫相似，但是也有其獨(dú)特的特點(diǎn)，化學(xué)發(fā)光免疫分析法是借助發(fā)光底物自身的發(fā)光強(qiáng)度來(lái)直接測(cè)定，測(cè)得的光量子數(shù)和待測(cè)樣本中的抗原/抗體濃度成正比，因此該方法可用于定性、定量、半定量測(cè)定中[12]。在檢測(cè)的工作原理上與ELISA不同，其不受游離血紅蛋白中類(lèi)過(guò)氧化物酶活性的影響，不會(huì)產(chǎn)生顏色反應(yīng)影響檢測(cè)結(jié)果。化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種異相免疫分析方法，抗原抗體能高效結(jié)合，靈敏度可達(dá)（10～22）mol/L，線性范圍較寬，其發(fā)光強(qiáng)度在4～6個(gè)量級(jí)，與待測(cè)物質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。且分析方法簡(jiǎn)單，大多數(shù)情況下僅需加入一種試劑或復(fù)合試劑就能完成全自動(dòng)化的操作。操作過(guò)程中無(wú)需任何光源照射，避免了光源穩(wěn)定性、光散射等因素的干擾，結(jié)果較為穩(wěn)定，誤差小。除此之外，化學(xué)發(fā)光免疫分析法的耗時(shí)短，能隨時(shí)檢測(cè)，適用于急診快速檢驗(yàn)中。

3.3 溶血標(biāo)本對(duì)ELISA法檢測(cè)HIV抗體結(jié)果的影響

溶血標(biāo)本會(huì)對(duì)多種檢測(cè)項(xiàng)目的結(jié)果產(chǎn)生一定影響，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性、假陰性等結(jié)果，影響臨床診療。本次研究中分析溶血標(biāo)本對(duì)HIV抗體檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果顯示：對(duì)采用ELISA檢測(cè)的標(biāo)本，隨著血液標(biāo)本的溶血程度加重，吸光度A值也逐漸提高，且假陽(yáng)性率也逐漸提高（P<0.05）;其中中度溶血組的假陽(yáng)性率為2.0%，重度溶血組的假陽(yáng)性率為6.0%，說(shuō)明對(duì)于采用ELISA法檢測(cè)HIV抗體時(shí)，標(biāo)本的溶血會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生明顯影響，極易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，影響臨床診療。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是：（1）ELISA檢測(cè)中，由于溶血后的血液標(biāo)本中游離血紅蛋白增加，在溫育操作中，血液中游離的血紅蛋白會(huì)被吸附到反應(yīng)孔中。血紅蛋白中的亞鐵血紅素具有類(lèi)似于過(guò)氧化物酶的作用，能在氧化劑的作用下催化顯色，因此溶血標(biāo)本檢測(cè)時(shí)游離血紅蛋白可能會(huì)與加入的化學(xué)發(fā)光底物液發(fā)生一定的反應(yīng)，出現(xiàn)異常顯色結(jié)果，導(dǎo)致假陽(yáng)性，或是檢測(cè)結(jié)果偏高[13]。（2）血紅素的紅色會(huì)干擾比色分析，一般可通過(guò)標(biāo)本空白部分來(lái)消除比色分析中的干擾，但是由于檢測(cè)中增加光的吸收，故而在波長(zhǎng)相近的比色試驗(yàn)中依然會(huì)產(chǎn)生一定的干擾性，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此ELISA檢驗(yàn)中受到標(biāo)本溶血的影響較大。

3.4 溶血標(biāo)本對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HIV抗體結(jié)果的影響

對(duì)于采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)的標(biāo)本，未溶血組與輕度溶血組、中度溶血組、重度溶血組的RLU值對(duì)比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且僅重度溶血組有1例假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率為1.0%，提示我們化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HIV抗體時(shí)，標(biāo)本的溶血對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響不大，主要是因?yàn)椋夯瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法的特異度高，一般不會(huì)受到各種因素的影響，假陽(yáng)性率低。檢測(cè)一般在封閉的流動(dòng)系統(tǒng)中進(jìn)行，從而避免了交叉感染的發(fā)生，也保障了試劑的穩(wěn)定性，保證了檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在HIV抗體檢測(cè)中應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法耗時(shí)短，一般可在20 min內(nèi)完成檢測(cè)，大大縮短初篩報(bào)告的出具時(shí)間，其檢測(cè)耗時(shí)明顯短于ELISA法。另外，化學(xué)發(fā)光免疫分析法的檢測(cè)靈敏度、特異度也高于ELISA法，因此具有更明顯的優(yōu)勢(shì)[14-15]。

在實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)工作中，血液標(biāo)本極易發(fā)生溶血現(xiàn)象，如血標(biāo)本送檢延遲、血標(biāo)本采集操作不當(dāng)?shù)染赡軐?dǎo)致溶血現(xiàn)象。而對(duì)于溶血標(biāo)本，檢驗(yàn)科需盡快與送檢科室聯(lián)系，并分析溶血的原因，結(jié)合檢驗(yàn)項(xiàng)目以及臨床實(shí)際。若檢測(cè)項(xiàng)目受溶血的影響較大，需及時(shí)通知相關(guān)醫(yī)護(hù)人員和受檢人員重新采集血標(biāo)本，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外還需加強(qiáng)對(duì)血標(biāo)本采集人員的培訓(xùn)教育，提高采集人員的業(yè)務(wù)能力，盡可能減少溶血標(biāo)本。

綜上所述，溶血標(biāo)本在ELISA檢測(cè)HIV抗體時(shí)影響較大，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果;對(duì)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)HIV抗體時(shí)影響不大?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法具有耗時(shí)短、靈敏度和特異度高、線性范圍廣、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，值得在HIV抗體檢測(cè)中應(yīng)用，同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)溶血標(biāo)本的管理，避免溶血對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的不良影響，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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（收稿日期：2021-02-18）