銀杏黃酮在紫外線輻射誘導的皮膚損傷和老化中的作用

徐晶晶　　柯月琴　　戴曉燕　　周瑜　　舒國斌　　童世紅

[摘要] 目的 探究銀杏黃酮在紫外線輻射誘導的皮膚損傷和老化中的作用。方法 實驗隨機分為正常組、模型組和銀杏黃酮20 mg/L組、40 mg/L組、80 mg/L組。結(jié)果 與正常組比較，模型組細胞活力顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高細胞活力（P<0.05）。與正常組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），線粒體膜電位顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低細胞凋亡率（P<0.05），顯著升高線粒體膜電位（P<0.05）。結(jié)論 銀杏黃酮對紫外線輻射誘導的皮膚成纖維細胞損傷具有保護和延緩光老化的作用。

[關(guān)鍵詞] 銀杏黃酮;紫外線輻射;皮膚老化;氧自由基

[中圖分類號] R751? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）08-0012-04

Role of ginkgo flavonoids in ultraviolet radiation-induced skin injury and aging

XU Jingjing1 KE Yueqin1? ?DAI Xiaoyan2? ?ZHOU Yu3? ?SHU Guobin1? ?TONG Shihong4

1.Department of Dermatology， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China; 2.Outpatient Infusion Room， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China; 3.Department of Clinical Laboratory， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China; 4.Stoma Wound Care Specialist Clinic， Ningbo Beilun District People's Hospital， Ningbo? ?315800， China

[Abstract] Objective To investigate the role of ginkgo flavonoids in ultraviolet radiation-induced skin injury and aging. Methods The experimental subjects were randomly divided into the normal group， the model group， ginkgo flavonoids 20 mg/L group， ginkgo flavonoids 40 mg/L group， and ginkgo flavonoids 80 mg/L group. Results Compared with the normal group， the cell viability in the model group was significantly decreased （P<0.05）; compared with the model group， the cell viability in the ginkgo flavonoids group significantly was increased （P<0.05）. Compared with the normal group， the apoptosis rate of the model group was significantly increased （P<0.05）， and the mitochondrial membrane potential in the model group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the apoptosis rate of the ginkgo flavonoids group was significantly decreased （P<0.05）， and the mitochondrial membrane potential of the ginkgo flavonoids group significantly increased （P<0.05）. Conclusion Ginkgo flavonoids have a protective effect on skin fibroblast injury induced by ultraviolet radiation and delays photoaging.

[Key words] Ginkgo flavonoids; Ultraviolet radiation; Skin aging; Oxygen free radicals

皮膚是機體應(yīng)對外界物理、化學和環(huán)境污染物的首要防御屏障[1]。多種環(huán)境因素作用于皮膚病的發(fā)生，其中日光紫外線輻射是引起皮膚病的一個重要因素。近年來由于自然環(huán)境破壞，紫外線輻射日益加劇，由此引起的皮膚病發(fā)病率逐年增高。銀杏葉提取物以銀杏的葉子為原料，該產(chǎn)品作用包括促進血液循環(huán)、抗氧化、抗衰老、抗癡呆、降低血壓、改善糖尿病等。有研究表明，銀杏黃酮在臨床上已用于心腦疾患等多種疾病的治療[2-3]，而對拮抗皮膚老化是否有明確的意義尚不明了。本實驗旨在探討銀杏黃酮在紫外線輻射誘導的皮膚損傷和老化中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與藥品

人皮膚成纖維細胞購自中國科學院典藏細胞庫。銀杏黃酮購自深圳市思美泉生物科技有限公司，貨號90045-36-6，純度>99%。

1.2 方法

1.2.1 分組? 體外培養(yǎng)人體正常皮膚成纖維細胞，隨機分為正常組、模型組和銀杏黃酮20 mg/L組、40 mg/L組、80 mg/L組。除正常組外，其余各組經(jīng)紫外線（使用UVA+UVB同時照射，照射總量為UVA：4.2 J/cm2;UVB：0.5 J/cm2）照射，在不同時間段（0、3、12、48 h）分別收集細胞并保存。

1.2.2? MTT檢測細胞活力? 細胞培養(yǎng)，每孔分別加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標儀檢測細胞活力。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和線粒體膜電位水平? ? 各組細胞，以每孔1×104個接種于24孔板中。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

取500 μl單細胞懸液，加入Rhodamine 123染液10 μl，37℃避光孵育30 min，用流式細胞儀檢測。激發(fā)波長507 nm，計數(shù)104個細胞，測定單個細胞熒光，用Rhodamine 123的熒光強度變化表示細胞線粒體膜電位。

1.2.4 細胞老化相關(guān)β-半乳糖苷酶的活性測定? 各組細胞按照5.0×104個ml的細胞密度接種，用40 g/L多聚醛固定細胞45 min，用X-Gal染液在37℃保溫4～8 h，再固定4 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。確定細胞老化相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數(shù)的百分比。

1.2.5 RT-qPCR檢測基因表達? 各組細胞均提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒使用說明進行PCR，每個樣品設(shè)3個重復，循環(huán)條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s;72℃ 30 s，共40個循環(huán);60℃延長5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達? 提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒進行蛋白定量。SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至PVDF上;分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜;再加入二抗室溫孵育2 h，后在暗室中曝光顯影，再定影，將膠片用Quantity One軟件分析各蛋白條帶蛋白表達。

1.2.7 熒光分析法檢測細胞內(nèi)OH、NO含量? 在Tris-HCl緩沖溶液中，鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生超OH、NO和有熒光效率的自氧化產(chǎn)物。在433.0 nm激發(fā)波長和494.5 nm發(fā)射波長條件下，檢測細胞內(nèi)OH、NO含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞活力比較

與正常組比較，模型組細胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高細胞活力，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組細胞凋亡率和線粒體膜電位比較

與正常組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高、線粒體膜電位水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低細胞凋亡率，顯著升高線粒體膜電位水平，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組細胞β-半乳糖苷酶的活性比較

與正常組比較，模型組β-半乳糖苷酶的活性染色陽性率顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低β-半乳糖苷酶的活性染色陽性率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組基因表達水平比較

與正常組比較，模型組Bcl-2、iNOS mRNA表達顯著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2 mRNA表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高Bcl-2、iNOS mRNA表達，顯著降低Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2 mRNA表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 各組蛋白表達水平比較

與正常組比較，模型組Bcl-2、iNOS蛋白表達顯著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著升高Bcl-2、iNOS蛋白表達，顯著降低Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD、COX-2蛋白表達，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

2.6 各組細胞內(nèi)OH、NO含量比較

與正常組比較，模型組細胞內(nèi)OH、NO含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，銀杏黃酮顯著降低細胞內(nèi)OH、NO含量，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表6。

3 討論

皮膚老化是由于紫外線長期輻射后，導致皮膚質(zhì)量下降[4-5]。UVB照射可導致皮膚出現(xiàn)皺紋、色素沉著、松弛等光老化現(xiàn)象[6-7]。UVA作用于細胞，在細胞內(nèi)能產(chǎn)生ROS。高水平的ROS引起細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，影響CD95/CD95L凋亡通路和多種凋亡相關(guān)基因的表達;同時活化細胞內(nèi)的ROS，啟動線粒體的去極化，使線粒體膜通透性增加，出現(xiàn)皮膚光老化[8-9]。

藥理學研究表明，銀杏葉提取物具有改善血液循環(huán)、降低心肌耗氧量、保護心腦血管、提高機體免疫功能等作用[10-11]。本實驗結(jié)果表明，人皮膚細胞損傷和老化后細胞活力顯著降低;而銀杏黃酮可以提升損傷細胞的活力。高陽等[12]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮處理后細胞存活率顯著提升。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，人皮膚細胞損傷和衰老后，β-半乳糖苷酶的活性染色陽性率顯著提高，但銀杏黃酮可顯著降低β-半乳糖苷酶表達。葛志華等[13]研究表明，衰老大鼠下頜下腺β-半乳糖苷酶表達增加，凋亡細胞數(shù)較正常組明顯增多。

趙麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏黃酮苷元可以下調(diào)Bax基因表達，上調(diào)Bcl-2基因表達。黎小瓊[15]研究表明，CD95、CD95L廣泛表達于多種上皮細胞的表面。陳志國等[16]研究表明，CD95/CD95L在胃癌組織中的表達顯著高于良性疾病組及正常胃黏膜組。竇婷婷[17]研究表明，pttg1在皮膚腫瘤中的表達顯著高于正常水平。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，人皮膚細胞損傷和衰老后，Bcl-2基因和蛋白表達顯著降低，Bax、CD95、CD95L、pttg1、CPD基因和蛋白表達顯著升高，但銀杏黃酮可顯著改善損傷和衰老。

銀杏黃酮類成分是銀杏葉提取物具有獨特藥理活性的藥效成分，具有抗氧化、清除自由基等功能[18-19]。清除自由基和活性氧，主要體現(xiàn)在抑制細胞內(nèi)COX-2和iNOS的活性[20]。本研究表明，人皮膚細胞損傷后細胞內(nèi)OH、NO含量顯著升高、iNOS基因和蛋白表達顯著降低、COX-2基因和蛋白表達顯著升高;而不同濃度的銀杏黃酮顯著降低細胞內(nèi)OH、NO含量，顯著升高iNOS基因和蛋白表達，顯著降低COX-2基因和蛋白表達。

綜上所述，銀杏黃酮對紫外線輻射誘導的皮膚成纖維細胞損傷具有保護和延緩光老化的作用。

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（收稿日期：2021-04-01）