靈芝菌絲毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)研究

孫國強(qiáng)，董金穎，曹發(fā)昊

（1.山西瑞芝生物科技有限公司，山西 運(yùn)城 044000；2.運(yùn)城學(xué)院，山西 運(yùn)城 044000）

靈芝（Ganoderma lucidum）也叫瑞草、仙草等，為名貴的藥用真菌[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗衰老、保肝和提高機(jī)體缺氧耐受力等活性[2-7]。目前，靈芝子實(shí)體和孢子主要作為保健食品應(yīng)用，但不管是野生采摘還是人工栽培的靈芝都極易受自然條件限制，生產(chǎn)效率低，產(chǎn)品質(zhì)量波動(dòng)大，生產(chǎn)規(guī)模遠(yuǎn)不能滿足市場需求[8]。近年來，采用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝菌絲，實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；慨a(chǎn)，成為解決上述問題的重要途徑[9]。研究表明，靈芝菌絲與子實(shí)體的營養(yǎng)成分十分相似，對(duì)人體同樣有功效作用[10]。

目前，國內(nèi)外針對(duì)靈芝子實(shí)體和靈芝孢子及其產(chǎn)品的毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)研究已經(jīng)開展了很多[11-17]，但針對(duì)菌絲的相關(guān)報(bào)道很少[18-19]，其作為食品應(yīng)用的毒理學(xué)研究不夠深入，尚缺安全性評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)支持。將靈芝菌絲作為原料加工成食品，可有效增加靈芝的附加值，產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值，因此開展其毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)試驗(yàn)尤為重要。本研究較系統(tǒng)地對(duì)靈芝菌絲的急性毒性、遺傳毒性等進(jìn)行了研究，以期為靈芝菌絲的安全食用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品

靈芝菌絲粉，由山西瑞芝生物科技有限公司培養(yǎng)靈芝菌絲，經(jīng)干燥、粉碎制得，該供試樣品為棕色粉末，置密閉、陰涼干燥處儲(chǔ)存。推薦成人服用量為3.0 g/（60 kg·d）。

1.2 動(dòng)物

SD 大鼠和ICR 小鼠由上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(滬)2012-0002。試驗(yàn)動(dòng)物飼料由浙江省試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為GB 14924.1—2001。試驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2013-0190，試驗(yàn)動(dòng)物室溫度為20 ～24 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%。

1.3 儀器與試劑

超凈工作臺(tái)（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；生物顯微鏡（深圳盛天儀器有限公司）；7180 型全自動(dòng)生化分析儀[日立（中國）有限公司]；XT-1800i 型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀（日本SYSMEX 株式會(huì)社）。

環(huán)磷酰胺CTX（上海華聯(lián)制藥公司）；絲裂霉素C（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；疊氮鈉（NaN3）、1,8二羥基蒽醌、2-AF、柔毛霉素、ICR-191（Sigma公司）。多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)制備大鼠肝S9，經(jīng)2-AF 和1,8-二羥基蒽醌測試具有生物活性，冷凍保存。TA97、TA98、TA100、TA1024 種鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株由上海疾病預(yù)防控制中心毒理科提供，經(jīng)生物學(xué)鑒定合格后用于試驗(yàn)。

1.4 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選擇最大耐受劑量法進(jìn)行大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。選20 只體重180 ～220 g 的SD 大鼠，雌雄各10 只。染毒前，禁食過夜但不限制飲水。設(shè)20 g·kg-1體重一個(gè)劑量組（相當(dāng)于推薦人服用量的400 倍），采用經(jīng)口灌胃方式，將靈芝菌絲粉碎后稱取100 g 加去離子水至200 mL 配成0.50 g·mL-1（最大可灌胃濃度），按20 mL·kg-1體重，灌胃2 次，每次間隔4 h。染毒后觀察小鼠的一般情況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限2 周。

1.4.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選擇最大耐受劑量法進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。選20 只18 ～22 g 體重的ICR 小鼠，雌雄各10 只。染毒前，禁食過夜但不限制飲水。設(shè)20 g·kg-1體重一個(gè)劑量組（相當(dāng)于推薦人服用量的400 倍）。用經(jīng)口灌胃方式，將靈芝菌絲粉碎后稱取100 g 加去離子水至200 mL 配成0.50 g·mL-1（最大可灌胃濃度），按20 mL·kg-1體重，灌胃2 次，每次間隔4 h。染毒后觀察小鼠的一般情況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限2 周。

1.5 遺傳毒性試驗(yàn)方法

1.5.1 Ames 試驗(yàn)

試驗(yàn)選用經(jīng)生物學(xué)鑒定為合格的TA97、TA98、TA100、TA1024 種鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。采用平板摻入法，選擇5 000 μg/皿為最高劑量。稱取靈芝菌絲1.0 g 加去離子水至20 mL，充分混勻，配成50 000 μg·mL-1，用去離子水依次5 倍稀 釋 成80 μg·mL-1、400 μg·mL-1、2 000 μg·mL-1、 10 000 μg·mL-1，各濃度均經(jīng)121 ℃、20 min 濕熱滅菌后用于試驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)皿加0.1 mL，即劑量分別為8 μg/ 皿、40 μg/ 皿、200 μg/ 皿、1 000 μg/ 皿、5 000 μg/皿。同時(shí)設(shè)有空白對(duì)照組、溶劑（H2O）對(duì)照組及陽性對(duì)照組（ICR-191、2-AF、絲裂霉素C、NaN3、柔毛霉素、1,8-二羥基蒽醌），各種菌株每個(gè)測試濃度設(shè)3 個(gè)平行皿，在加、不加S9兩種條件下試驗(yàn)，重復(fù)測試一次。直接計(jì)數(shù)各培養(yǎng)基上菌株的回變菌落數(shù)。

1.5.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

采用間隔24 h 二次給予樣品進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)。25 ～30 g 體重的50 只ICR 小鼠，隨機(jī)分為5 組，每組雌、雄各5 只。設(shè)3 個(gè)劑量組 2.5 g·kg-1、5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1體重（分別相當(dāng)于推薦人服用量的50、100 和200 倍），用去離子水配制。并設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照組（CTX 0.06 g·kg-1）， 3 個(gè)劑量組分別稱取靈芝菌絲25 g、50 g、100 g，然后分別加去離子水至200 mL 配成0.125 g·mL-1、 0.250 g·mL-1、0.500 g·mL-1的試樣，再按20 mL·kg-1灌胃；對(duì)照組也作相同處理。以最后一次給靈芝菌絲后計(jì)時(shí)6 h，處死小鼠后再取其股骨骨髓制片，用甲醇固定Giemsa 染色后再進(jìn)行鏡檢，每只小鼠計(jì)數(shù)PCE（嗜多染紅細(xì)胞）1 000 個(gè)來計(jì)算微核率。

1.5.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

選50 只25 ～35 g 體重的ICR 小鼠，每組雌、雄各5 只，隨機(jī)分成5 組。設(shè)3 個(gè)劑量組2.5 g·kg-1、 5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1體重（分別相當(dāng)于推薦人服用量的50、100 和200 倍），用去離子水配制。另設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照組（絲裂霉素C 0.002 g·kg-1）。 3 個(gè)劑量組分別稱取靈芝菌絲25 g、50 g 和100 g， 然后加去離子水至200 mL 配成0.125 g·mL-1、 0.250 g·mL-1、0.500 g·mL-1的試樣，再按20 mL·kg-1連續(xù)灌胃5 d；對(duì)照組也作相同處理。在首次給試樣的第35 天以頸椎脫臼法處死小鼠，將每組的各只小鼠兩側(cè)附睪取下，放入已加入適量生理鹽水的平皿，附睪用剪刀剪碎后用4 層擦鏡紙吸濾，涂片后自然干燥，再用甲醇固定后以1%伊紅進(jìn)行染色。高倍鏡下檢查精子形態(tài)，每只小鼠查看1 000 個(gè)完整精子，記錄畸變精子類型和數(shù)目，計(jì)算畸形率。

1.6 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)

選80 只50 ～70 g 體重的SD 大鼠，每組雌雄各10 只，隨機(jī)分為4 組。大鼠自由進(jìn)食和飲水采用單籠飼養(yǎng)。設(shè)3 個(gè)劑量組和1 個(gè)陰性對(duì)照組，高、中、低3個(gè)劑量分別為5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、 1.25 g·kg-1，相當(dāng)于推薦人服用量的100、50 和25 倍。試驗(yàn)以給予飼料喂養(yǎng)的方式，按體重的10%折算靈芝菌絲用量，采用逐級(jí)放大方式充分均勻拌入各個(gè)劑量組的基礎(chǔ)飼料中，各劑量均制作20 kg 加藥飼料。高、中、低3 個(gè)劑量組靈芝菌絲加入量為1 000 g、500 g、250 g：干酪素加入量為200 g、100 g、50 g。高、中、低3 個(gè)劑量組靈芝菌絲分別占飼料的5.0%、2.5%、1.25%。連續(xù)觀察30 d，每周記體重1 次、進(jìn)食量2 次，核算食物利用率。試驗(yàn)?zāi)┢诩吹? 周，稱體重后禁食過夜，次日在空腹稱體重后從頸靜脈取血進(jìn)行血液學(xué)和血生化指標(biāo)檢測。大體解剖所有大鼠，將肝、腎、脾、睪丸（卵巢）稱重，計(jì)算其臟體比。同時(shí)，對(duì)臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用“X—±S”樣式。先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊時(shí)選用單因素方差分析法進(jìn)行總體比較，若存在差異，再與對(duì)照組的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均數(shù)間的兩兩相比；原始數(shù)據(jù)不滿足方差齊性時(shí)，可選用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

從表1 可以看出，染毒后觀察期內(nèi)大鼠未出現(xiàn)中毒癥狀和死亡。該靈芝菌絲的雌、雄兩性別急性經(jīng)口最大耐受劑量均＞20 g·kg-1體重，屬無毒級(jí)。

表1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

從表2 可以看出，染毒后觀察期間試驗(yàn)小鼠未出現(xiàn)中毒癥狀，也無死亡。該靈芝菌絲的雌、雄兩性別的急性經(jīng)口最大耐受劑量均＞20 g·kg-1體重，屬無毒級(jí)。

表2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Ames 試驗(yàn)結(jié)果

從表3、表4 可見，在加不加S9兩種條件下，靈芝菌絲各個(gè)劑量的回變菌落數(shù)都未超過空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組的2 倍，再者各劑量組別之間無明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系，該靈芝菌絲細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)的結(jié)果為陰性。

表3 第一次Ames 試驗(yàn)結(jié)果

表4 第二次Ames 試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

從表5 可以看出，各個(gè)劑量組的嗜多染紅細(xì)胞（Polychromatic Erythrocyte，PCE）與紅細(xì)胞（Red Blood Cell，RBC）總數(shù)的比值（PCE/RBC）均不少于對(duì)照組的20%，因而不具有骨髓抑制作用。再用泊松檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)，比較各劑量組與陰性對(duì)照組的微核率，差異無顯著性（P＞0.05），表明靈芝菌絲哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)的結(jié)果是陰性的。

表5 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

從表6 可以看出，采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，比較各劑量組和陰性對(duì)照組的精子畸形率，均無顯著性差異（P＞0.05），說明靈芝菌絲小鼠精子畸形試驗(yàn)的結(jié)果為陰性。

表6 小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果

2.3 大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

以1.25 g·kg-1、2.50 g·kg-1和5.00 g·kg-1劑量（相當(dāng)于推薦人服用量的25、50 和100 倍）的樣品連續(xù)喂養(yǎng)大鼠30 d，試驗(yàn)期間各組大鼠均沒有出現(xiàn)異常癥狀和體征，也無死亡。

2.3.1 對(duì)大鼠體重、周進(jìn)食量、食物利用率的影響從表7、表8、表9 可以看出，比較高、中、低三劑量組與陰性對(duì)照組的大鼠體重、周進(jìn)食量、總進(jìn)食量、食物利用率以及體重增重量，經(jīng)方差分析或秩和檢驗(yàn)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表7 靈芝菌絲對(duì)大鼠體重的影響

表8 靈芝菌絲對(duì)大鼠周進(jìn)食量的影響

表9 靈芝菌絲對(duì)大鼠食物利用率的影響

2.3.2 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

從表10、表11 可以看出，比較各劑量組與陰性對(duì)照組大鼠的白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞，經(jīng)方差分析或秩和檢驗(yàn)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表10 靈芝菌絲對(duì)大鼠白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白的影響

2.3.3 對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響

從表12、表13 可以看出，比較各劑量組與陰性對(duì)照組大鼠的血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯、總膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白蛋白/球蛋白和血糖，經(jīng)方差分析或秩和檢驗(yàn)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表12 靈芝菌絲對(duì)大鼠丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯和總膽固醇的影響

表13 靈芝菌絲對(duì)大鼠總蛋白、白蛋白、球蛋白、白/球比和血糖的影響

2.3.4 對(duì)大鼠臟器重和臟體比的影響

從表14、表15 可以看出，比較各個(gè)劑量組與陰性對(duì)照組大鼠的肝、腎、脾、睪丸（卵巢）重、各臟體比[肝/體、腎/體、脾/體、睪丸（卵巢）/體]，經(jīng)方差分析或秩和檢驗(yàn)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表14 靈芝菌絲對(duì)大鼠肝、腎、脾、睪丸（卵巢）重的影響

表15 靈芝菌絲對(duì)大鼠周臟體比的影響

2.3.5 大鼠病理組織學(xué)檢查結(jié)果

從表16 可以看出，大體解剖未見明顯異常，各臟器的組織學(xué)改變多為散發(fā)，陰性對(duì)照組和高劑量組中差別不明顯，所以可判斷各臟器的改變與靈芝菌絲的作用無直接因果關(guān)系。

表16 靈芝菌絲病理學(xué)組織觀察結(jié)果 （單位：只）

（續(xù)表16）

3 結(jié)論

參照國家相關(guān)法規(guī)[20-21]和相關(guān)文獻(xiàn)[22-24]，對(duì)靈芝菌絲進(jìn)行了毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)靈芝菌絲以最大給藥量20 g·kg-1（相當(dāng)于人推薦服用劑量的400 倍）經(jīng)口方式給小鼠灌胃后，小鼠沒有出現(xiàn)中毒癥狀及死亡，急性經(jīng)口毒性為無毒。3項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果也都是陰性。大鼠30 d 喂養(yǎng)試驗(yàn)，以5.00 g·kg-1、2.50 g·kg-1、1.25 g·kg-1劑量（分別相當(dāng)于推薦人體用量的100、50、25 倍）的樣品 30 d 連續(xù)喂養(yǎng)大鼠，所有大鼠試驗(yàn)期內(nèi)均未見異常癥狀和體征，也無死亡。所有大鼠的體重、體重增重、周進(jìn)食量、總進(jìn)食量、食物利用率、血常規(guī)和血液生化指標(biāo)、臟器重及臟體比等都未發(fā)生明顯變化；經(jīng)大體解剖和組織病理學(xué)檢查，所有大鼠均未出現(xiàn)與靈芝菌絲有關(guān)的異常變化，表明靈芝菌絲30 d 喂養(yǎng)對(duì)大鼠未產(chǎn)生毒副作用。上述結(jié)論表明，靈芝菌絲具備無遺傳毒性、無致突變性的特點(diǎn)，本研究為靈芝菌絲產(chǎn)品的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)，對(duì)推動(dòng)靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有積極意義。