基于QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定樹莓中乙基多殺菌素殘留

王乾麗，簡銀池，黃永橋，周恒美

（貴州省檢測技術研究應用中心，貴州 貴陽 550000）

乙基多殺菌素（Spinetoram）是多殺菌素（Spinosad）的換代產品，其原藥的有效成分是乙基多殺菌素-J（XDE-175-J）和乙基多殺菌素-L（XDE-175-L）的混合物（比值為3 ∶1）[1]，主要用于防治鱗翅目害蟲（小菜蛾、甜菜夜蛾）及纓翅目害蟲（薊馬）等[2]。樹莓擁有世界“第三代水果之王”的美譽，具有清除體內自由基、增葉黃素、抗腫瘤、抗癌、抗炎和促進人體新陳代謝等作用，具有極高的保健功效[3-7]，深受人們喜愛，在對貴州一些樹莓生產基地調研時發(fā)現，在樹莓大規(guī)模種植的過程中普遍用到乙基多殺菌素防治蟲害[8]，但使用不當會導致該藥殘留并威脅人們健康。

關于乙基多殺菌素在水體、土壤、蔬菜等基質中的殘留分析方法已有不少報道，李剛等[9]、傅強等[10]、牛艷等[11]分別對洛黨參中乙基多殺菌素殘留、水稻樣品中乙基多殺菌素及其代謝物殘留、枸杞中乙基多殺菌素及其代謝物殘留進行了研究，關于快速測定樹莓中乙基多殺菌素殘留的方法研究鮮見報道，本文采用QuEChERS 法結合超高效液相色譜-串聯質譜法測定樹莓中乙基多殺菌素殘留，能解決樣品基質前處理煩瑣、溶劑使用量大的問題。超高效液相色譜-串聯質譜法具有檢出限低、靈敏度高和檢測耗時短等特點，本試驗采用基于QuEChERS 的超高效液相色譜-串聯質譜法對樹莓中乙基多殺菌素進行殘留分析研究，為評價與檢測樹莓中的乙基多殺菌素殘留狀況及其質量控制提供科學依據，對樹莓發(fā)展成綠色功能性食品和深加工、產業(yè)鏈延長具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品的制備

原料樹莓在超市購買3 個品種，分別為紅樹莓、黑樹莓、小蜜莓；選擇成熟度為全熟的樹莓果，且大小一致、色澤相近、無機械損傷，采用研缽研磨成勻漿，備用。

1.2 材料與試劑

乙基多殺菌素標準品（純度：99.2%±0.5%，天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈、甲醇、乙酸乙酯，均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，德國Merck 公司；十八烷基鍵合硅膠C18吸附劑（40 ～63 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）（40 ～63 μm）、石墨化碳黑（Graphitizing of Carbon Black，GCB）、QuEChERs 萃取鹽包（4 g Na2SO4+1 g NaCl）、蔬菜113 鹽包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3C6H5O7+0.5 g C6H6Na2O7），賽默飛世爾科技有限公司；EN 方法凈化管（含色素類水果和蔬 菜，150 mg MgSO4+25 mg PSA+2.5 mg GCB）、AOAC 方法凈化管（含色素類水果和蔬菜，150 mg MgSO4+50 mg PSA+50 mg GCB），月旭科技（上海）股份有限公司。

1.3 儀器與設備

Agilent 1290-6470 超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，配有ESI 源美國Agilent 公司；Blixer3 攪拌機，ROBOT COUPA 公司；LT2002 電子天平，天量儀器有限公司；L-550 離心機，湘儀離心機儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標準溶液配制

（1）標準工作液配制。 準確移取濃度為 10.0 μg·mL-1的標準儲備液1.00 mL 于10 mL 的 棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，渦旋混勻，得到濃度為1.0 μg·mL-1的標準工作液；準確移取濃度為 10.0 μg·mL-1的標準儲備液50.0 μL 于10 mL 的棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，渦旋混勻，得到濃度為50.0 ng·mL-1的標準工作液。

（2）溶劑標準工作曲線。移取計算量的標準工作液于1 mL 的容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成乙基多殺菌素-J（XDE-175-J）濃度為0.037 5 ng·mL-1、 0.075 0 ng·mL-1、0.375 0 ng·mL-1、0.750 0 ng·mL-1、 1.500 0 ng·mL-1、3.750 0 ng·mL-1、7.500 0 ng·mL-1； 乙基多殺菌素-L（XDE-175-L）濃度為0.012 5 ng·mL-1、0.025 0 ng·mL-1、0.125 0 ng·mL-1、0.250 0 ng·mL-1、 0.500 0 ng·mL-1、1.250 0 ng·mL-1和2.500 0 ng·mL-1的溶劑標準工作曲線，現配現用。

（3）基質標準工作曲線。移取計算量的標準工作液于1 mL 的容量瓶中，用空白樣品提取液定容至刻度，配制成乙基多殺菌素-J（XDE-175-J）濃度為0.0375 ng·mL-1、0.075 ng·mL-1、0.375 ng·mL-1、0.750 ng·mL-1、1.500 ng·mL-1、3.750 ng·mL-1和 7.500 ng·mL-1；乙基多殺菌素-L（XDE-175-L）濃度為0.012 5 ng·mL-1、0.025 0 ng·mL-1、0.125 0 ng·mL-1、0.250 0 ng·mL-1、0.500 0 ng·mL-1、1.250 0 ng·mL-1和 2.500 0 ng·mL-1的溶劑標準工作曲線，現配現用。

1.4.2 樣品前處理

①提取。稱取5.0 g 制樣的樹莓樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 乙腈溶液振蕩提取10 min 后，靜置30 min，依次加入1.5 g 乙酸鈉、6.0 g 無水硫酸鎂，振蕩10 min，再4 500 r·min-1離心5 min。②凈化。取2.0 mL上清液至裝有凈化材料（300 mg MgSO4+ 100 mg PSA+100 mg GCB）的10 mL 離心管中，渦旋大約2 min，離心后取上清液到2 mL 離心管中， 16 000 r·min-1離 心5 min 后， 取上清液裝瓶供UPLC-MS/MS 檢測。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus-C18反相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A：0.1%甲酸水（含2 mmol·L-1乙酸銨）溶液，B：乙腈；流速： 0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣體積：2.0 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫梯度

1.4.4 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；多反應監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：4.5 kV；霧化器壓力：45 psi；干燥氣流速：6 L·min-1；干燥氣溫度：300 ℃；鞘氣流速：10 L·min-1；鞘氣溫度：300 ℃；其他質譜條件見表2。

表2 質譜分析參數

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的優(yōu)化

本實驗通過加標回收方式考察了乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷和酸化乙腈5 種提取劑的提取效果。稱取5.0 g 空白樹莓樣品于50 mL 離心管中，每個處理做6 個平行，加入15 mL 溶劑振蕩提取10 min 后，靜置30 min，依次加入3.0 g 乙酸鈉、3.0 g 無水硫酸鎂，渦旋離心后檢測。由圖1 可知，乙腈和丙酮的提取效率較理想，但是樹莓色澤較深，用丙酮提取的色素較多，其顏色明顯比其他溶劑提取液深，可能會對儀器造成損害；為了降低敏感性藥物的降解，維持溶液酸堿環(huán)境的穩(wěn)定性，實驗中常加入甲酸、冰醋酸、氨水等緩沖劑，于是本實驗考察了酸化乙腈的提取能力，結果顯示，在加入緩沖劑后，回收率有所降低，并不能提高乙腈的提取效率，綜上，乙腈為本實驗的理想提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對乙基多殺菌素的提取效果（n=6）

2.1.2 鹽析方法的優(yōu)化

在目標化合物萃取過程中，為了更好地促進相分離和鹽析效應，實驗中考察了QuEChERS 初始方法、美國AOAC 2007.01、歐盟EN15662 3 種經典方法中所用的分配鹽，初始方法萃取鹽包（4 g Na2SO4+1 g NaCl）為1 號鹽包、美國AOAC 2007.01 法萃取鹽包 （6 g MgSO4+1.5 g NaOAc）為2號鹽包、 歐盟EN 15662 法萃取鹽包（4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g Na3C6H5O7+0.5 g C6H6Na2O7）為3 號鹽包，實驗結果如表3 所示。使用2 號鹽包時XDE-175-J、XDE-175-L 的回收率最好，且精密度最小，可能原因是MgSO4在乙腈中的析出效果最優(yōu)，同時實驗中發(fā)現樹莓含水量較高，2 號鹽包的無水MgSO4較多，能更好地促進有機相和水相的分離，從而提高萃取效率，因此選擇2 號鹽包作為本實驗的鹽析方法。

表3 不同鹽析方法對回收率的影響（n=6）

2.1.3 凈化方法的優(yōu)化

根據提取化合物的性質和基質特點，選擇最優(yōu)的凈化劑，對于減少基質效應、提高被測化合物靈敏度和回收率極其重要。本實驗比較了C18、PSA、GCB 的不同組合和用量，以期提高目標化合物提取效率的同時減少基質效應的影響。由圖2 可知，4 種凈化方法，回收率大小為（MgSO4+PSA+GCB）＞（MgSO4+PSA+GCB+C18）＞（MgSO4+PSA+C18）＞（MgSO4+PSA），組合MgSO4+PSA+GCB 回收率最好，加入C18后回收率下降，可能C18對目標化合物有吸附作用，而單獨用PSA 回收率較低，加入GCB 后回收率提高顯著，原因是樹莓含色素較多，顏色較深，而GCB 能夠強烈吸附色素類物質[12]。

圖2 不同凈化劑對回收率的影響（n=6）

凈化劑的用量也會影響回收率，本實驗對選出的最優(yōu)凈化劑組合進行了使用量的考察，按照MgSO4∶PSA ∶GCB=3 ∶1 ∶1 的比例考察了總量為250 mg、350 mg、500 mg 和600 mg 的4 組凈化劑對回收率的影響。結果如圖3 所示，總量為 500 mg 和600 mg 時回收率較好，總量為600 mg 時回收率無明顯增長，考慮大批量處理的實驗成本，選擇總量為500 mg（MgSO4∶PSA ∶GCB=3 ∶1 ∶1）為本實驗的凈化劑使用量。

圖3 凈化劑使用量對回收率的影響（n=6）

2.2 方法學評價

2.2.1 基質效應的評價及消除

樣品基質中脂類、色素、糖類、可溶性蛋白質、胺類和各種無機鹽等經過前處理仍存留在溶液中，有研究表明內源性物質中磷脂對化合物的質譜響應影響較大，較難從樣品中清除從而產生嚴重抑制作用[13-14]，一般用空白基質匹配標準溶液校正和使用同位素內標兩種方法來消除或則補償基質效應，當|ME|＜10%時，ME 可忽略不計；當|ME|在10%～20%時，存在較弱的基質效應；當|ME|＞20%時，存在強基質效應[15]。由表4 可知，XDE-175-J 和XDE-175-L 的ME 值分別為-29.2%、-36.1%，存在強基質抑制效應。

2.2.2 線性關系、檢出限、定量線性和基質效應

按照“1.4.1”方法配制標準溶液，在優(yōu)化好的質譜色譜條件下測定相應的峰面積，分別得到XDE-175-J（0.037 5 ～7.500 0 μg·L-1）、XDE-175-L（0.012 5 ～2.500 0 μg·L-1）的標準曲線方程和線性關系。結果見表4，線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.999，采用加標逐級稀釋的方法，XDE-175-J 定量限為0.075 μg·㎏-1，XDE-175-L 定量限 0.025 μg·㎏-1，本方法定量限及檢出限較低，能較好滿足樹莓中微量乙基多殺菌素的檢測要求。

表4 乙基多殺菌素的線性方程、相關系數、基質效應、檢出限及定量限

2.2.3 回收率和精密度

選取黑樹莓陰性樣品進行加標，其中XDE-175-J加標水平為0.15 μg·kg-1、0.75 μg·kg-1、1.50 μg·kg-1，XDE-175-L 加 標 水 平0.05 μg·kg-1、0.25 μg·kg-1、0.50 μg·kg-1，按照優(yōu)化條件進行提取和分析。結果如表5，日內平均回收率為92.7%～105.5%，日內變異系數（CV）為2.5%～8.6%；日間平均回收率為94.6%～108.3%，日間變異系數（CV）為2.8%～10.7%。

表5 乙基多殺菌素的回收率和精密度（n=6）

3 結論

本文建立了QuECHERS 結合超高效液相色譜-串聯質譜法快速測定樹莓中乙基多殺菌素殘留檢測方法。建立的方法檢出限低、靈敏度和重現性好，能夠滿足樹莓中痕量乙基多殺菌素殘留的快速、準確、大批量檢測要求，為樹莓的安全生產和食品安全監(jiān)管部門提供可靠的技術支持和更多的理論 依據。