獺兔腸乳桿菌的分離鑒定

黃婧文，李歡，周亞南，區(qū)海蘊(yùn)，吳晨曉，梁潤(rùn)利，肖芬，朱芝秀

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

腸乳桿菌是指一類從腸道分離得到，能利用葡萄糖或乳糖產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，其革蘭氏染色呈陽(yáng)性，無(wú)芽孢，不運(yùn)動(dòng)，是一類常見(jiàn)益生菌[1]。目前，益生菌常用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，對(duì)抑制病原菌、刺激胃腸道蠕動(dòng)、提高機(jī)體消化吸收能力、提高機(jī)體免疫力具有一定作用[2]。動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中，抗生素濫用現(xiàn)象屢禁不止，但隨著人們對(duì)動(dòng)物食品品質(zhì)要求的提高，監(jiān)管部門及市場(chǎng)對(duì)安全、高效、無(wú)毒的生物制劑的要求也越來(lái)越高[3]，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)文件要求，從2020年7月1日起，我國(guó)開始全面禁用飼用抗生素。2020年9月27日國(guó)務(wù)院辦公廳印發(fā)的《關(guān)于促進(jìn)畜牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的意見(jiàn)》（國(guó)辦發(fā)[2020]31號(hào)），明確提出“持續(xù)推動(dòng)畜牧業(yè)綠色循環(huán)發(fā)展”，要求嚴(yán)格執(zhí)行飼料添加劑安全使用規(guī)范，加強(qiáng)獸用抗菌藥綜合治理，實(shí)施動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)、藥物飼料添加劑退出和獸用抗菌藥使用減量化行動(dòng)。從長(zhǎng)遠(yuǎn)角度看，禁用抗生素是畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)邁向綠色、可持續(xù)發(fā)展的重要里程碑，無(wú)抗養(yǎng)殖方法，代表了健康養(yǎng)殖的發(fā)展方向，也是今后發(fā)展的必然方向。但短期內(nèi)，替抗藥物的發(fā)展還未成熟，禁抗令的實(shí)施，可能導(dǎo)致諸多行業(yè)問(wèn)題[4]。因此，在如今“禁抗”的背景趨勢(shì)下，研發(fā)應(yīng)用綠色、高效、健康的抗生素替代品，縮短“替抗”的過(guò)渡時(shí)間是當(dāng)前養(yǎng)殖領(lǐng)域中迫切需要解決的問(wèn)題，益生菌應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)已成必然趨勢(shì)[5]。獺兔作為一種皮肉兼用的小型食草動(dòng)物，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，然而還鮮見(jiàn)獺兔源益生菌的篩選應(yīng)用[6]。本試驗(yàn)從健康獺兔十二指腸道中分離乳酸菌，并進(jìn)行鑒定，得到7株能穩(wěn)定產(chǎn)酸的優(yōu)勢(shì)菌株，旨在探索合理高效的分離方法，并為后續(xù)開發(fā)有利于生產(chǎn)的益生菌制劑提供潛在菌株，以期在臨床上減少或替代抗生素使用，為開發(fā)適用于獺兔生產(chǎn)的乳酸菌制劑提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)，促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

健康獺兔2只，2～3kg/只，購(gòu)自南昌某兔場(chǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

革蘭氏染色液：自制；MRS改良培養(yǎng)基、MRS肉湯：購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；微量發(fā)酵管：購(gòu)自杭州天和微生物有限公司。

2 方法

2.1 樣品采集

從兔場(chǎng)中隨機(jī)挑選健康且精神狀態(tài)佳的獺兔，麻醉處死后以0.1%新潔爾滅消毒液浸泡消毒30min，然后使用一次性無(wú)菌手術(shù)刀沿腹中線打開腹腔，截取其十二指腸，立即使用生理鹽水灌洗所截取腸道，直至灌洗水清澈后剪開腸道，用滅菌藥匙分別刮取0.5g腸黏膜，加入5mL生理鹽水中，充分搖勻，即得到初始樣品。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

用移液槍分別吸取100uL樣品置于5mL MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)48h，用無(wú)菌棉簽蘸取培養(yǎng)液，均勻涂布于MRS改良培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h后，選取溶鈣圈明顯且形態(tài)一致、大小相等、半透明的單個(gè)圓形菌落于MRS培養(yǎng)基上反復(fù)純化，直至得到單一一致菌落，分別命名為T-C-4,T-C-6,T-C-8,T-C-10,T-C-12,T-C-14,T-C-16。

2.3 細(xì)菌鑒定

2.3.1 細(xì)菌初篩。對(duì)分離菌進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察其形態(tài)、大小、有無(wú)芽孢等形態(tài)學(xué)特征并記錄。

2.3.2 細(xì)菌生化鑒定。挑取MRS培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)的單個(gè)菌落，依照說(shuō)明書分別接種于過(guò)氧化氫酶、蛋白胨水、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、七葉苷、菊糖、棉子糖、山梨糖、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、尿素、硫化氫、木糖、松三糖、纖維二塘、MR/VP等微量發(fā)酵管中，37℃恒溫培養(yǎng)，滴加試劑，觀察并對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[7]和《乳酸菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》[8]，初步確定細(xì)菌種屬。

2.3.3 16sRNA鑒定。挑取分離菌單個(gè)菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h，進(jìn)行變性處理后，12 000 r/min，離心10 min，取上清液，利用16S r DNA通用測(cè)序引物16S-F:5′-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3′，16S-R:5′-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3′，進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。PCR擴(kuò)增程序如下：于95℃預(yù)變性5 min;95℃變性45 s,54℃退火1 min,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);72℃再延伸8 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果并拍照。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用BLAST工具在線比對(duì),通過(guò)Megalign和MEGA 7.0軟件分別進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,確定菌種名。

3 結(jié)果

3.1 分離篩選結(jié)果

T-C-4、T-C-6、T-C-8、T-C-10、T-C-12、T-C-14、T-C-16菌落在MRS改良培養(yǎng)基上均呈現(xiàn)明顯溶鈣圈，菌落大小中等、顏色灰白、半透明，邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)，見(jiàn)圖1。革蘭氏染色結(jié)果見(jiàn)圖2，顯示為G+桿菌，未發(fā)現(xiàn)芽孢。

圖1 分離菌培養(yǎng)菌落

圖2 分離菌G染色結(jié)果

3.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1，經(jīng)對(duì)照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸菌分類鑒定及試驗(yàn)方法》后，初步得出T-C-4、T-C-6、T-C-8、T-C-10、T-C-12、T-C-14、T-C-16均為腸乳桿菌。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

3.3 16sRNA分子鑒定結(jié)果

3.3.1 分離菌PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)圖3，PCR產(chǎn)物在15 g/L瓊脂凝膠上的電泳，在1500 bp出現(xiàn)單一明亮的目的片段，且未發(fā)現(xiàn)雜帶。

圖3 分離菌電泳圖

3.3.2 同源性比對(duì)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送至湖南擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，經(jīng)比對(duì)可知分離菌與唾液乳酸桿菌同源性最高（圖4）。

圖4 分離菌同源性比對(duì)結(jié)果

3.3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。從Gen Bank中挑選23株乳酸桿菌屬菌株，利用MEGA7.0軟件的Clustal W算法進(jìn)行多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖4。其 中T-C-6、T-C8、T-C-12、T-C-16與 菌 株NR112759.1、AB326353.1、AF089108.2親緣關(guān)系最近，與菌株MR041457.1、LC589224.1親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖5）。

圖5 分離菌系統(tǒng)發(fā)育樹

4 討論分析

本次試驗(yàn)分離得到7株乳酸菌。經(jīng)過(guò)革蘭氏染色鏡檢，生化特性初步鑒定，結(jié)果與乳桿菌高度相似，經(jīng)16sRNA分子生物學(xué)鑒定，同源性比對(duì)和進(jìn)化樹構(gòu)建，確定分離菌均為唾液乳酸桿菌（Lactobacillus salivarius strain），說(shuō)明唾液乳桿菌是獺兔十二指腸中穩(wěn)定存在的一種優(yōu)勢(shì)菌落，與曾博報(bào)道的結(jié)果相符合[9]，為研究獺兔腸道微生態(tài)提供了理論依據(jù)。

在生化試驗(yàn)中，分離菌吲哚試驗(yàn)為陰性，與蔣磊的報(bào)道相同[10]，硝酸鹽還原反應(yīng)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性，不能分解尿素；大部分分解甘露醇、蔗糖，與劉小蘭報(bào)道的菌種相符[11]，均分解菊糖、棉子糖、山梨糖，少數(shù)分解麥芽糖、乳糖，均不分解阿拉伯糖、木糖、松三糖、纖維二糖，與桑夢(mèng)琪、趙藝竹、張海威等報(bào)道的分離菌不符[12～14]，部分分離菌可分解的糖類有差異，這些可能與菌株個(gè)體差異有關(guān)。

在獺兔養(yǎng)殖中，飼料改變、氣候變化、過(guò)量使用抗生素類藥等均可導(dǎo)致其腸道菌群失調(diào)，引起腹瀉并導(dǎo)致死亡[15]。隨著獺兔生產(chǎn)朝著規(guī)?；?、集約化發(fā)展,腹瀉已成為獺兔最主要的疾病之一,給獺兔養(yǎng)殖帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，在一定時(shí)期內(nèi)，抗生素作為治療獺兔細(xì)菌性腹瀉的首選藥物，取得了良好的療效[16]，但是隨著“無(wú)抗”養(yǎng)殖時(shí)代的到來(lái)，在不使用抗生素的條件下防治獺兔腹瀉病，為養(yǎng)殖戶帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，益生菌作為抗生素的重要替代品，在獺兔生產(chǎn)中地位至關(guān)重要。時(shí)云朵的報(bào)道提示，在許多對(duì)益生菌治療獺兔疾病的研究中，所使用的并非獺兔源益生菌，故獺兔源益生菌的篩選應(yīng)用研究有待進(jìn)一步加強(qiáng)[6]，本試驗(yàn)分離得到的菌株，可應(yīng)用于后續(xù)研究獺兔源益生菌制劑，增加了可應(yīng)用于獺兔源微生態(tài)制劑的后備菌株，以期開發(fā)適用于獺兔生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)微生態(tài)制劑。