Sema4D在心血管疾病中的研究進展

陳建綜述 夏豪審校

軸突導向蛋白(semaphorin)是一類蛋白的總稱，其家族成員由約30種結構高度保守的蛋白組成。根據結構特征和與細胞膜的連接方式，這些蛋白被分為了8類，其中1、2類表達于無脊椎動物，3～7類在脊椎動物中表達，V(viruses)類存在于某些DNA病毒中[1]。它們都具有一個包含500個氨基酸的sema區(qū)域[2]，又各自有其特異性結構，根據蛋白與細胞膜之間連接方式的不同，其具有分泌蛋白和跨膜蛋白2種存在形式，通過旁分泌和自分泌的形式調節(jié)細胞行為。最初它們被認為主要存在于神經系統(tǒng)，作為軸突導向因子參與神經系統(tǒng)的發(fā)育[3]，后來的研究發(fā)現，其廣泛分布于神經、骨骼肌、內皮、腫瘤等各個組織和器官，并參與細胞增殖、遷移、黏附、免疫應答、心血管發(fā)育等多種生理病理過程[4-5]。其中第四類家族成員Sema4D又稱CD100，最初于T細胞表面被發(fā)現，相關研究主要涉及腫瘤、神經膠質細胞生長及骨代謝等[6-7]，近年來發(fā)現，它也參與一些心血管疾病的病理過程，然而對此分子在疾病中發(fā)揮的作用和具體分子機制研究并未深入，對其進一步研究有望為相關疾病的預防和治療提供新的靶點。

1 Sema4D的生物學特征

Sema4D是一種Ⅰ型跨膜蛋白，從病毒到哺乳動物，Sema4D均有表達且結構保持著高度保守。人類的Sema4D蛋白由位于人類9號染色體9q22.2位置的SEMA4D基因表達，分子量約為150 kDa[8]。在人體淋巴結、脾臟、腦組織內及各類免疫細胞中呈高表達，心臟、胃腸、肺等也顯著表達。Sema4D整個分子包含862個氨基酸，從胞外的N端開始依次為一個氨基末端信號序列、一個富含糖基化位點的sema區(qū)域、一個PSI(plexin-semaphorin-integrin)結構域及免疫球蛋白樣區(qū)域，胞內的尾部則包含許多絲蘇氨酸磷酸化位點(圖1)。Sema結構域是Sema4D蛋白的特征性結構域，通過X線晶體學與3D建模顯示，它含有一個與整合素α結構相似的七葉β-螺旋結構，參與和整合素之間的信號轉導。Sema結構域是位于蛋白N端的一個單拷貝區(qū)域，以同源二聚體的形式表達于細胞表面，并可形成二聚體進行信號轉導[1]，它是與受體特異性結合和信號轉導的關鍵結構。Sema4D的羧基末端幾乎都包含一個與整合素β鏈同源的富含半胱氨酸的PSI區(qū)域，PSI區(qū)域對于sema結構域的同源二聚相當重要。Sema4D在人體內分布廣泛，雖然它是一種膜固有蛋白，但在蛋白激酶A、干擾素基因刺激因子(STING)等分子的介導下，Sema4D分子可被金屬蛋白酶ADAM17裂解進入血液，成為游離狀態(tài)(sSema4D)[9]，sSema4D分子量約120 kDa，2種形態(tài)都可廣泛參與人體的病理生理過程[10]，并參與細胞間的黏附、T細胞啟動、血管生成、炎性反應的介導等。

注：所有成員都具有相同的Sema區(qū)域，但根據其所在種屬，與細胞膜的連接方式，以及IG樣區(qū)域、7次血小板反應蛋白-1重復等獨特結構，將semaphorin蛋白家族分為7類

Sema4D可作為配體且和受體結合發(fā)揮生物學功能，plexinB1是Sema4D的高親和力受體，在人體多種組織和細胞表面表達[7]，是一種跨膜受體。Plexin在胞外包含與Sema4D同源的sema區(qū)域，和sema蛋白形成二聚介導信號轉導；胞內有一個高度保守的Ras家族GTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)結構，當plexin受體結合sema區(qū)域時，GAP區(qū)域被激活導致Ras和Rap家族GTPase的激活，而Ras/Rap家族GTPase如Rac1、Rnd1、RhoD的激活可以促進整合素(integrin)的功能來調控細胞黏附和細胞骨架。另一方面，plexinB1可以招募并激活酪氨酸激酶受體met并與之形成受體復合物，激活下游的信號分子，介導細胞及腫瘤的侵襲性生長[11]。研究表明[12]，plexinB1對胞內met的招募和激活是Sema4D介導的促血管生長作用所必須的。此外，plexinB1受體的C末端可以通過調控LARG——一種鳥苷酸交換因子(GEFs)的活性來介導小G蛋白RhoA的激活，對下游的MAPK、PI3K、ROCK通路產生調控作用，進而廣泛參與人體多種生理功能的調節(jié)。CD72是Sema4D的另一種受體，其對Sema4D的親和力相對較低，主要存在于免疫細胞中，如B細胞、T細胞、樹突狀細胞等。對免疫細胞的增殖、成熟、抗體的合成分泌起到調控作用，CD72尾部含有2個免疫受體酪氨酸抑制模體(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM)，可結合酪氨酸磷酸酶SHP-1使其發(fā)揮抑制細胞信號的作用[13]。Sema4D與CD72結合可使ITIM去磷酸化，從而減弱SHP-1的抑制作用，提高細胞免疫應答水平。

2 Sema4D在心血管疾病中的作用機制

2.1 Sema4D與動脈粥樣硬化 動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心血管系統(tǒng)常見的疾病，也是心肌梗死和腦卒中的主要原因。多年以來AS的發(fā)生一直被認為是經典的單核細胞驅動過程[14]。單核細胞、血小板與內皮細胞間黏附并向內皮下遷移是粥樣硬化形成的關鍵步驟[15-16]，此外脂質代謝異常和血小板異常激活參與了病變的進程，而Sema4D可能對這些病理過程起到了促進作用。

Gong等[17]研究發(fā)現，冠狀動脈粥樣硬化患者血清游離Sema4D水平較對照組顯著增高，且隨著冠狀動脈狹窄程度上升而升高。進一步研究發(fā)現，在小鼠血管損傷模型的血栓形成過程中，Sema4D及plexinB1受體的表達明顯增加，并參與血小板與內皮細胞的相互作用，促進血小板的黏附與聚集[18]。體內外實驗均表明，Sema4D參與了血小板的過度激活，在血管損傷模型中，缺乏Sema4D的小鼠進行損傷處理后出現的動脈阻塞癥狀出現較輕且較晚。在血脂異常小鼠模型中同樣發(fā)現，Sema4D陰性小鼠的血小板聚集、脂質沉積、動脈阻塞程度明顯下降[19]，在Zhu等[20]的研究中，通過對LDLR(-/-)和 Sema4D(-/-)LDLR(-/-)小鼠分別進行6個月的高脂飼養(yǎng)，Sema4D敲除組小鼠的主動脈脂質沉積明顯低于對照組，血管損傷后阻塞的幾率降低了6倍，血小板聚集降低到野生型小鼠水平。這些結果表明，Sema4D促進了血小板的病理性激活及動脈的脂質沉積，促進了AS的發(fā)生。另一方面，內皮細胞表達的Sema4D可以與人單核細胞、巨噬細胞、泡沫細胞表面的plexinB2受體結合，介導單核細胞與內皮細胞的黏附[21]，促進血液中的單核細胞向內皮下的遷移。Cui等[22]的研究證實，巨噬細胞對富含Sema4D的表面具有更強的趨化性，而粥樣硬化區(qū)域的內皮細胞、巨噬細胞、泡沫細胞的Sema4D表達均有明顯升高[23]，這可能促進了相關炎性細胞的趨化作用，參與了AS的病理性進程。同時一項臨床研究顯示[24]，血清水平sSema4D低的ST段抬高型心肌梗死患者行PCI術后，發(fā)生心血管不良事件的風險明顯降低。

這些研究表明，Sema4D可能通過促進單核—內皮細胞的黏附和遷移、血小板的病理性激活、血管壁的脂質沉積及促進血管新生的方式促進AS的發(fā)生，Sema4D可能是防治AS的一個潛在靶點?，F代醫(yī)學研究表明，動脈粥樣硬化是急性心肌梗死發(fā)生的重要危險因素，Sema4D對于動脈粥樣硬及心肌梗死發(fā)生發(fā)展的影響和作用機制的研究目前尚缺乏，對此方向的研究將會具有重要臨床價值。

2.2 Sema4D與心房顫動和心房重構 心房顫動(atrial fibrillation，AF)是臨床上常見的一種心律失常，往往導致患者的生活質量下降及心血管事件的發(fā)生。心房顫動患者心房內血流的紊亂可導致心腔內附壁血栓的形成進而增加缺血性卒中的風險。盡管心房顫動的機制還未完全闡明，但血小板的激活及炎性反應在心房顫動發(fā)生的過程中起到了重要作用，同時左心房直徑(LAD)也與心房顫動患者血清炎性因子的水平有關[25-26]。

Sema4D在血小板激活和凝血過程起到了重要的調控作用，參與血小板聚集與附壁血栓形成，心房顫動患者血清Sema4D的高表達可能對血栓形成起到了促進作用。另外Sema4D可通過RhoGTP、R-Ras、NF-κB等信號通路，介導細胞增殖分化、炎性反應等[27]，這可能也對心房顫動起到了促進作用。Xiang等[28]研究了心房顫動患者的血清Sema4D水平，并探究了Sema4D水平與LAD的關聯；113例住院患者被分成陣發(fā)性心房顫動、非陣發(fā)性心房顫動及無心房顫動的陰性對照3組，并測定血清Sema4D和LAD水平。結果表明，陣發(fā)性、非陣發(fā)性心房顫動患者sSema4D水平顯著高于陰性對照組，非陣發(fā)性心房顫動sSema4D水平高于陣發(fā)性心房顫動，此外其血清水平還與LAD呈正相關，這說明Sema4D可能參與了心房顫動及心房重構的過程。大量研究表明，血清Sema4D水平的升高可反映炎性細胞的激活，而心房顫動患者血清Sema4D水平升高提示Sema4D可能成為炎性反應和心房顫動之間的橋梁，對其進一步研究可能發(fā)現心房顫動的新型分子機制。

2.3 Sema4D與心力衰竭 心力衰竭是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，涉及炎性反應、神經激素失調、生物力學改變、心室重構等多種病理過程[29-30]。IL-2、IL-6、TNF-α、淋巴細胞、巨噬細胞、內皮細胞等多種細胞和炎性因子參與其中，在發(fā)生炎性反應時，這些細胞表面的Sema4D分子可脫落并進入血液循環(huán)，參與內皮、單核細胞之間的黏附、趨化等相互作用，并可調控炎性細胞IL-6、TNF-α的表達[31]。這表明Sema4D可能參與心力衰竭的病理過程。Willner等[32]的研究比較了心力衰竭患者與正常對照組血清Sema4D和NT-proBNP水平及這2種分子之間的相關性，并評估了心力衰竭患者急性加重期和緩解期的Sema4D水平變化情況。結果表明，相較于對照組，心力衰竭患者的血清Sema4D和NT-proBNP水平均顯著增高，但區(qū)別于NT-proBNP，Sema4D基線水平與血漿肌酐水平相關，而與左心室射血分數無關，且在患者臨床癥狀改善后，Sema4D水平可迅速下降。這提示相較于NT-proBNP，Sema4D具有快速反映病情緩解和腎功能狀況的優(yōu)勢，這為心力衰竭提供了一個可能的生物標志物。另一方面，Sema4D本身是一種具有生物活性的分子，表達于T細胞、單核細胞、血小板等細胞表面，并在激活后通過金屬蛋白酶的裂解進入血液，參與炎性反應、血管生成等生理過程，這些都是心力衰竭的重要病理機制，并可參與多種疾病的進展。在心力衰竭的發(fā)生過程中，升高的Sema4D水平是否又促進了心室重構、炎性反應等過程，對Sema4D或其受體的干預能否成為新的治療靶點，這些都是值得進行進一步研究的方向。在最近的一項臨床研究中[33]，研究者通過對154例臨床病例的觀測，探討了心力衰竭、心室重構與血清sSema4D水平的關系，通過對weber心功能分級、左心室舒張末期內徑、左心房內徑及血清sSema4D水平的測定，發(fā)現血清sSema4D水平與心功能和心室重構密切相關，低水平sSema4D是心室重構的重要保護性因素。這項研究也為深入研究sSema4D對于心力衰竭影響的信號機制、發(fā)現新藥物、探究新的心力衰竭的病理機制提供了臨床理論支持。

2.4 Sema4D與血管內皮細胞功能障礙 內皮細胞廣泛分布于血管壁，具有調節(jié)凝血反應、影響血管通透性、調節(jié)血管平滑肌收縮和舒張的功能。保持內皮細胞的結構和功能正常，對維持血管內的平衡和穩(wěn)態(tài)起著重要作用，其功能失調對動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用。

研究發(fā)現，在糖尿病視網膜微血管病變的小鼠模型中，轉錄因子IRF1可在低氧誘導下募集到Sema4D的啟動子區(qū)域，提高其轉錄水平。升高的血清Sema4D可結合內皮細胞PlexinB1受體，并激活plexinB1-mDIA1/Src信號通路，使Src、FAK磷酸化，介導內皮細胞的增殖和遷移，并促進血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)的磷酸化，使血管的通透性增加[34]。在同樣的模型中，敲除plexinB1受體的小鼠，血管損傷后發(fā)生的血管新生和血管滲漏顯著降低，血管內皮功能得到改善[35]。Chen等[36]研究發(fā)現，Sema4D水平和血管內皮生長因子水平呈正相關，兩者具有協同促進內皮細胞的增殖和遷移，增加血管通透性，抑制內皮細胞的凋亡，從而促進新生血管的形成的作用。Sema4D對內皮細胞生長、血管生成的促進作用可能與met、Rho/ROCK信號通路相關[37]。這些研究表明，Sema4D對內皮細胞維持功能穩(wěn)定和生長修復具有調節(jié)作用，而目前對其在促進內皮細胞增殖遷移和血管新生作用的研究多涉及腫瘤領域，在心血管方面Sema4D對內皮細胞的影響則是值得進一步研究的問題。

通過總結以上基礎與臨床研究發(fā)現，Sema4D參與了眾多心血管系統(tǒng)疾病的病理進程，然而目前卻缺乏對其深入的完整的病理機制的研究，將目前Sema4D涉及心血管疾病的研究總結見表1。

表1 Sema4D在心血管疾病中的動物與臨床研究總結

3 總結與展望

綜上所述，Sema4D分子不僅是一個免疫調節(jié)分子，它也參與了許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程，并且具有促進炎性反應、細胞趨化、細胞增殖遷移的作用。大量研究表明，Sema4D在心血管發(fā)育和各種疾病中發(fā)揮了重要作用，盡管其在這些疾病中發(fā)揮作用的具體分子機制尚不明確，但Sema4D水平在這些疾病過程中的改變是確切的，進一步闡明其在心血管系統(tǒng)疾病中的信號機制，可能為腫瘤、動脈粥樣硬化、血管狹窄及其他相關疾病的促血管、抗血管治療提供新的機會。相信隨著研究的不斷深入，Sema4D在心血管疾病中的作用將被揭開，并有望為臨床治療相關心血管疾病提供新的治療靶點和生物標記。