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    宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B表達水平與術后復發(fā)的相關性研究

    2022-04-27 03:47:10張文莉王彩麗馮彩霞王蕊高瑞李光張興旺
    疑難病雜志 2022年4期
    關鍵詞:水平研究

    張文莉,王彩麗,馮彩霞,王蕊,高瑞,李光,張興旺

    宮頸鱗癌是婦科常見生殖道惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率有所上升,并呈年輕化趨勢。宮頸鱗癌是宮頸癌最常見的病理類型,約占70%以上[1],其發(fā)生發(fā)展受多因素、多階段長期作用影響,分析其可能的分子機制,對宮頸鱗癌早期診斷、預后干預具有重要臨床意義。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類單鏈非編碼小分子RNA,通過與靶基因3’-非翻譯端結合抑制其表達來參與腫瘤的增殖、分化、遷移和凋亡[2-3]。miRNA在腫瘤中的作用越來越受到關注。研究發(fā)現(xiàn)[4],miR-448在非小細胞肺癌中低表達,上調miR-448可抑制腫瘤細胞增殖分化、遷移侵襲作用,可能通過靶向鋅指E盒結合的同源盒蛋白2發(fā)揮抑癌作用。關于miR-448在宮頸鱗癌中的表達尚不清楚。賴氨酸特異性脫甲基酶2B(lysine-specific demethylase 2B,KDM2B)參與細胞的正常生命進程,如細胞衰老、細胞分化、干細胞自我更新等[5]。楊慧蘭等[6]報道,KDM2B在惡性卵巢癌中表達上調,腫瘤低分化、淋巴結轉移患者KDM2B陽性表達率更高,提示KDM2B參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展進程。KDM2B是否在宮頸鱗癌中發(fā)揮同樣的分子作用尚未見報道。因此,本研究通過檢測宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表達情況,分析其可能的作用機制,探究其臨床價值,報道如下。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選取2017年8月—2020年3月于榆林市第一醫(yī)院婦產(chǎn)科行腹腔鏡手術及術后病理檢查確診為宮頸鱗癌患者96例為研究對象,年齡44~72(49.57±5.63)歲,年齡>50歲者32例,年齡≤50歲者64例;腫瘤分化程度:高分化50例,低、中分化46例;FIGO分期[7]:Ⅰ~Ⅱ期47例,Ⅲ期49例;浸潤宮頸纖維肌壁深度≤1/2者34例,浸潤宮頸纖維肌壁深度>1/2者62例;有脈管癌栓39例,無脈管癌栓57例;有淋巴結轉移40例,無淋巴結轉移56例。手術獲取患者宮頸鱗癌組織和癌旁正常宮頸組織。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(榆醫(yī)倫審2017-32號),患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

    1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①均經(jīng)病理組織檢查確診;②術前3個月內無內分泌類、激素類或抗生素類藥物治療史;③無圍產(chǎn)期癥狀;④臨床資料完整。(2)排除標準:①合并其他惡性腫瘤;②嚴重心、肝、腎、肺等器質性疾??;③術前行放療、化療、生物治療等;④失訪患者。

    1.3 觀測指標與方法

    1.3.1 miR-448、KDM2B mRNA表達水平檢測:采用熒光定量PCR技術(熒光定量PCR儀購自拓赫機電科技上海有限公司,型號THT-96G)檢測miR-448、KDM2B mRNA表達水平。先取宮頸鱗癌組織和癌旁正常宮頸組織各20 mg置于裂解液200 μl中,搗碎、勻漿,再利用TRIzol試劑(上海通蔚生物有限公司)提取總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA純度,以OD260/OD280值1.8~2.0為純度較好。使用逆轉錄試劑盒(上海通蔚生物有限公司)將RNA反轉錄為cDNA,再進行PCR擴增,所有過程均嚴格按照試劑盒說明書操作步驟執(zhí)行。循環(huán)參數(shù):95℃ 預變性3 min,90℃ 變性10 s,60℃ 退火20 s,72℃ 延伸30 s,共40個循環(huán)。利用2-△△Ct法計算miR-448、KDM2B mRNA表達水平。以U6為內參,miR-448上游引物為5’-CATTACGGAGCCCAGTGTT-3’,下游引物為5’-CTGATTCCCCCGACATFCTT-3’;KDM2B mRNA上游引物為5’-TCGGACTAAGCTTGAGCCATA-3’,下游引物為5’-CGAAGTCGCCCAATAGAATCG-3’;U6上游引物為5’-GGGCTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物為5’-GAGCGTGCAGATAATTGACAAGG-3’。重復3次,取平均值。引物由北京曠博生物技術股份有限公司合成。

    1.3.2 KDM2B蛋白檢測:采用免疫組織化學法(上海通蔚生物有限公司)對宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織進行SP染色,檢測過程均按照試劑盒說明書步驟操作,工作液濃度1∶200,以磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機選取3個高倍清晰視野,最終結果取平均值。按染色強度計分:細胞未著色計0分,淡黃色計1分,棕黃色計2分,深棕色計3分;按陽性細胞所占百分比計分:<25%計1分,25%~50%計2分,>50%計3分。染色強度計分與陽性細胞所占百分比計分乘積作為最終結果[8],≥3分判定為陽性(+),否則為陰性(-)。

    1.3.3 病情復發(fā)情況:術后第1天開始隨訪,以門診或電話方式隨訪18個月,前6個月內每2個月隨訪1次,之后每3個月隨訪1次,隨訪終止日期為患者復發(fā)或2021年9月30日。復發(fā)判斷標準[9]:患者有復發(fā)癥狀,盆腔、細胞學及常規(guī)影像學檢查異常,且通過活檢或手術確定。根據(jù)隨訪期間宮頸鱗癌患者復發(fā)情況,將其分為復發(fā)組37例和未復發(fā)組59例。

    2 結 果

    2.1 不同組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較 宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平明顯低于正常宮頸組織(P<0.01),KDM2B mRNA表達水平明顯高于正常宮頸組織(P<0.01),見表1。

    表1 宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較

    2.2 復發(fā)組與未復發(fā)組患者宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較 復發(fā)組患者宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平低于未復發(fā)組,KDM2B mRNA水平明顯高于未復發(fā)組(P<0.01),見表2。

    表2 復發(fā)組和未復發(fā)組宮頸鱗癌組織中miR-448、KDM2B mRNA表達水平比較

    2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織KDM2B蛋白表達比較 免疫組織化學染色顯示,KDM2B主要定位于宮頸鱗癌細胞的細胞核,陽性表達產(chǎn)物由弱到強依次呈淺黃色、黃棕色、棕色或深棕色分布,見圖1。宮頸鱗癌組織中KDM2B蛋白陽性64例(66.67%),正常宮頸組織中KDM2B蛋白陽性33例(34.38%),2組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=20.023,P<0.001)。

    圖1 宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中KDM2B蛋白表達情況(免疫組織化學染色,×100)

    2.4 miR-448、KDM2B mRNA表達水平在不同宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)中比較 miR-448、KDM2B mRNA表達水平在宮頸鱗癌患者年齡、浸潤深度、是否合并脈管癌栓方面比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);腫瘤低中分化、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結轉移患者宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平明顯低于高分化、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、無淋巴結轉移患者(P<0.05),KDM2B mRNA表達水平明顯高于高分化、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、無淋巴結轉移患者(P<0.05),見表3。

    表3 miR-448、KDM2B mRNA表達水平在不同宮頸鱗癌患者臨床病理參數(shù)中比較

    2.5 miR-448與KDM2B mRNA表達的相關性分析 宮頸鱗癌組織中miR-448與KDM2B mRNA表達水平呈負相關(r=-0.605,P<0.001)。

    2.6 影響宮頸鱗癌患者術后復發(fā)的危險因素分析 以宮頸鱗癌患者術后是否發(fā)生復發(fā)為因變量(1=是,0=否),以腫瘤分化程度(1=低中分化,0=高分化)、FIGO分期(1=Ⅲ期,0=Ⅰ~Ⅱ期)、淋巴結是否轉移(1=是,0=否)、miR-448和KDM2B mRNA連續(xù)變量為自變量進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,腫瘤低中分化、FIGO分期Ⅲ期、發(fā)生淋巴結轉移、miR-448低表達、KDM2B mRNA高表達是影響宮頸鱗癌患者術后發(fā)生復發(fā)的獨立危險因素(P<0.05),見表4。

    表4 影響宮頸鱗癌患者術后復發(fā)的危險因素Logistic回歸分析

    3 討 論

    miRNA是一類由20~22個核苷酸組成的非編碼核酸單鏈小分子,通過抑制靶mRNA翻譯或轉錄后水平參與各種生理調節(jié)[10-11]。不同的miRNA或同一miRNA在不同腫瘤中可能存在表達異質性。miR-448是一種常見miRNA,研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織和細胞中miR-448呈現(xiàn)低表達,miR-448過表達可抑制胰腺癌細胞的遷移、侵襲和增殖[12]。另有國外學者研究發(fā)現(xiàn),非小細胞肺癌細胞中miR-448表達下調,miR-448過表達通過抑制非小細胞肺癌中的胰島素受體底物2表達來抑制細胞增殖、轉移和上皮間質轉化,提示miR-448在非小細胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因作用,可逆轉疾病進展和不良臨床結局[13]。Pu等[14]研究報道,在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞系中,miR-448表達降低而賴氨酸特異性脫甲基酶5B表達升高,且miR-448表達與患者的N分期、淋巴結轉移有一定關系,得出賴氨酸特異性脫甲基酶5B介導的miR-448上調通過抑制轉化生長因子β誘導轉錄因子1抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞進展,從而減緩腫瘤生長。本結果顯示,宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平明顯低于正常宮頸組織,與Pu等[14]研究類似,表明miR-448可能與宮頸鱗癌的發(fā)生有關。進一步研究發(fā)現(xiàn),宮頸鱗癌患者腫瘤分化程度越低、FIGO分期越高,其miR-448表達水平越低;且發(fā)生淋巴結轉移患者宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平顯著低于無淋巴結轉移患者,表明miR-448可能參與宮頸鱗癌患者腫瘤分化、侵襲和轉移過程,高水平miR-448發(fā)揮抑癌作用[15-17]。

    表觀遺傳因子KDM2B是一種新型致癌因子。Quan等[18]研究報道,KDM2B通過單極紡錘體—結合蛋白1調節(jié)Hippo通路,促進胰腺導管腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。侯海瑞等[19]研究顯示,惡性卵巢組織中KDM2B呈高表達,且與腫瘤組織分級、淋巴結轉移、FIGO分期相關。本研究結果顯示,宮頸鱗癌組織中KDM2B呈高表達,其在腫瘤組織中的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織,腫瘤低、中分化、FIGO分期Ⅲ期、有淋巴結轉移患者宮頸鱗癌組織中KDM2B mRNA表達水平明顯高于高分化、FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期、無淋巴結轉移患者,表明高水平KDM2B對宮頸鱗癌的發(fā)生和進展起促進作用,與其他研究表達趨勢一致[20-22]。最近一項研究發(fā)現(xiàn),KDM2B可激活前列腺癌腫瘤細胞中的黏著斑激酶(FAK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)位點,證實了FAK/PI3K信號通路在調節(jié)前列腺癌細胞遷移中的作用,揭示了組蛋白脫甲基化酶可能通過協(xié)調不同信號通路來共同參與腫瘤細胞的遷移[23]。Hong等[24]研究發(fā)現(xiàn),miR-448通過刺激糖酵解促進胃癌細胞增殖,通過生物信息學方法篩選出KDM2B是miR-448的候選轉錄抑制因子,并利用熒光素酶實驗證實了KDM2B是miR-448的直接靶點,在胃癌細胞中發(fā)揮重要作用。本研究利用Pearson相關性分析發(fā)現(xiàn),宮頸鱗癌組織中miR-448和KDM2B mRNA表達水平呈負相關,推測低水平的miR-448可能靶向上調KDM2B表達,參與宮頸鱗癌細胞增殖分化、遷移侵襲等過程,具體作用方式或機制還需開展體外實驗進一步分析驗證。研究顯示,miR-448低表達的肺癌患者預后較差,而KDM2B陽性表達的胃癌患者中位生存期較短[20,25-26]。本研究中,復發(fā)組宮頸鱗癌組織中miR-448表達水平較未復發(fā)組低,KDM2B mRNA表達水平較未復發(fā)組高,與既往研究相似,表明miR-448和KDM2B mRNA表達可能與宮頸鱗癌患者術后復發(fā)情況有關。本研究還發(fā)現(xiàn),miR-448低表達、KDM2B mRNA高表達是影響宮頸鱗癌患者術后發(fā)生復發(fā)的獨立危險因素,表明miR-448和KDM2B可能作為指示宮頸鱗癌患者術后復發(fā)的潛在指標。

    綜上所述,宮頸鱗癌患者腫瘤組織中miR-448呈低表達,KDM2B呈高表達,二者可能在分子水平上存在靶向關系,共同作用參與腫瘤細胞增殖分化、遷移侵襲等過程,并可作為指示宮頸鱗癌患者術后復發(fā)的潛在指標。具體作用機制有待進一步體外實驗研究。

    利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

    作者貢獻聲明

    張文莉、王彩麗:設計研究方案,課題設計,實施研究過程,論文撰寫;馮彩霞、王蕊:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;高瑞:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;李光、張興旺:進行統(tǒng)計學分析

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