• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    泛素結(jié)合酶9 通過(guò)核因子κB 通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901 凋亡的研究

    2022-04-27 02:15:30袁金華曾憲晶劉伍才羅亮
    藥品評(píng)價(jià) 2022年3期
    關(guān)鍵詞:泛素脂質(zhì)體細(xì)胞周期

    袁金華,曾憲晶,劉伍才,羅亮

    井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院,江西 吉安 343000

    胃癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤,根據(jù)全球癌癥研究機(jī)構(gòu)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),胃癌位于全球惡性腫瘤發(fā)病的第五位,死亡率位于第三位。我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū),發(fā)病率和死亡率分別占到全球的42.6%和45.0%[1],且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。當(dāng)前胃癌治療方法主要是手術(shù)、放療和化療,但預(yù)后較差,尋找有效的治療手段對(duì)本病的治療具有重要意義。

    研究表明:核因子-κB(NF-κB)是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,NF-κB 信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞増殖、分化和凋亡等重要生理功能,與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[2]。泛素結(jié)合酶9(Ubc9)是小泛素相關(guān)修飾物(SUMO)過(guò)程中唯一的結(jié)合酶,Ubc9 在細(xì)胞增殖、有絲分裂、周期進(jìn)程、分化等方面發(fā)揮著重要作用[3],Ubc9 在多種腫瘤中過(guò)表達(dá),可能參與了腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的病理過(guò)程,并且可能與腫瘤的耐藥相關(guān)[4],研究已證實(shí)Ubc9 是一個(gè)促癌基因[5],抑制Ubc9 基因后NF-κB 信號(hào)通路的凋亡蛋白降低[6]?;诖?,我們推測(cè)Ubc9 基因可能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖及凋亡,為治療提供理論參考。

    1 材料與方法

    1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

    胃癌SGC7901 細(xì)胞株(購(gòu)自上海賽默生物有限公司),兔抗Ubc9 單克隆抗體、兔抗p65 單克隆抗體、兔抗IKBα 單克隆抗體、兔抗Bcl-2 單克隆抗體、山羊抗小鼠β-actin(美國(guó)Abcam 公司),Ubc9 引物(Generay Biotech 公司),RNA 提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),PCR 檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),Opti-DMEM、轉(zhuǎn)染試 劑Lipofectamine 2000(Invitrogen 公 司),Trizol Reagent(Invitrogen 公司),胎牛血清(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),RPIM-1640 培養(yǎng)基(Hyclone公司)。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、轉(zhuǎn)染

    SGC7901 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPIM-1640 培養(yǎng)基中,于5%二氧化碳、37 ℃培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng),每3~4 d 按照1∶3 比例傳代1 次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。按5×104mL 的細(xì)胞密度接種至六孔板中后放入恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為四組:正常胃癌細(xì)胞A 組(Normal 組),脂質(zhì)體B 組(Lipo-2000 組),空載質(zhì)粒C 組(NC-shRNA 組),及目的質(zhì)粒D 組(Ubc9-shRNA 組),質(zhì)粒的構(gòu)建與測(cè)序均由上海吉瑪公司負(fù)責(zé)完成,細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法:準(zhǔn)備5 個(gè)1.5 mL的EP 管,分別向每管內(nèi)加入0.5 mL Opti-DMEM,其中2 個(gè)EP 管做好標(biāo)記分別加入10 μg 空載質(zhì)粒及目的質(zhì)粒,余3 管加入20 μL 的lipo2000,混合后靜置。接著向加入lipo2000 的3 個(gè)EP 管分別加入目的質(zhì)粒、空載質(zhì)粒以及500 μL Opti-DMEM,混勻,最后將配制好的各EP 管內(nèi)液體分別加入所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)皿中,置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3 qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后,使用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以此為模板進(jìn)行qRT-PCR 目的基因擴(kuò)增,結(jié)果計(jì)算根據(jù)LC 480檢測(cè)得出的CT 值為cDNA 熒光強(qiáng)度達(dá)到所設(shè)定閥值的循環(huán)數(shù),ΔCt=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值,每個(gè)樣品中mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-ΔCT× 100%。

    表1 引物序列

    1.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

    采用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白,BCA 法測(cè)定總蛋白濃度,上樣SDS-PAGE 膠,電泳,轉(zhuǎn)膜、封閉,抗體孵育,顯影成像,利用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶灰度值,記錄其相對(duì)表達(dá)量。

    1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡

    細(xì)胞周期檢測(cè):調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,離心,棄上清,重懸后收集細(xì)胞,采用1 mL 已配制好的周期試劑檢測(cè)各組細(xì)胞的周期,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反應(yīng)后,30 min 內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的周期。細(xì)胞凋亡測(cè)定:調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL,離心,棄上清,重懸后收集細(xì)胞,滴 入500 μL Binding Buffer溶液重懸后加入5 μL AnnexinV-FITC 混勻,再加入5 μL 碘化丙啶,混勻,室溫避光孵育,1 h 內(nèi)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    2.1 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

    24 h 后在熒光顯微鏡下觀察熒光的顯示情況,當(dāng)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染后,質(zhì)粒進(jìn)入胃癌細(xì)胞即可在熒光顯微鏡呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的綠色熒光,見(jiàn)圖1。

    圖1 熒光顯微鏡下觀察mir-Ubc9向SGC 7901細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況(×200)

    2.2 RT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組Ubc9 基因mRNA 的表達(dá)水平

    各組細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)的處理24 h 后,將Normal 組,Lipo-2000 組,空載質(zhì)粒NC-shRNA 組作為對(duì)照組,與對(duì)照組相比,人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA 質(zhì)粒(Ubc9-shRNA 組)能顯著地抑制胃癌SGC7901 中Ubc9 基因的表達(dá)(0.31±0.06),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

    圖2 各組泛素結(jié)合酶9 mRNA表達(dá)情況:A.正常胃癌細(xì)胞組;B.脂質(zhì)體組;C.空載質(zhì)粒組;D.目的質(zhì)粒組

    2.3 Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染mir Ubc9 后細(xì)胞內(nèi)Ubc9與α-SMA 的表達(dá)水平

    與對(duì)照組相比,人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA 質(zhì)粒明顯抑制了SGC7901 中Ubc9 蛋白的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.28±0.06,P<0.05)。同時(shí)SGC7901細(xì)胞內(nèi)α-SMA蛋白表達(dá)量也明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.28±0.06,P<0.05)。見(jiàn)圖3、表2。

    圖3 各組泛素結(jié)合酶9和a-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)情況:A.正常胃癌細(xì)胞組;B.脂質(zhì)體組;C.空載質(zhì)粒組;D.目的質(zhì)粒組

    表2 各組泛素結(jié)合酶9和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白蛋白表達(dá)水平(,n=4)

    表2 各組泛素結(jié)合酶9和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白蛋白表達(dá)水平(,n=4)

    注:與D組比較,aP<0.05。

    2.4 流式檢測(cè)結(jié)果

    2.4.1 細(xì)胞周期結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后胃癌SGC7901 細(xì)胞的周期被阻滯在G2/M 期,并且能夠促進(jìn)SGC7901 的凋亡,與各對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(20.45±2.71,P<0.05),提示Ubc9 基因可能調(diào)控SGC7901 細(xì)胞的細(xì)胞周期。見(jiàn)圖4、表3。

    圖4 細(xì)胞周期情況:A.正常胃癌細(xì)胞組;B.脂質(zhì)體組;C.空載質(zhì)粒組;D.目的質(zhì)粒組

    表3 各組SGC 7901細(xì)胞周期情況(,n=4)

    表3 各組SGC 7901細(xì)胞周期情況(,n=4)

    注:與D組比較,aP<0.05。

    2.4.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞的凋亡增加明顯,與各對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示Ubc9 基因可能參與調(diào)控SGC7901 細(xì)胞的凋亡。見(jiàn)圖5、表4。

    表4 各組SGC 7901細(xì)胞凋亡率(,n=4)

    表4 各組SGC 7901細(xì)胞凋亡率(,n=4)

    注:與D組比較,aP<0.05。

    圖5 細(xì)胞凋亡情況:A.正常胃癌細(xì)胞組;B.脂質(zhì)體組;C.空載質(zhì)粒組;D.目的質(zhì)粒組

    2.5 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞IKBα、p65 與Bcl-2 蛋白表達(dá)結(jié)果

    與對(duì)照組相比,Ubc9-shRNA 組SGC7901 細(xì)胞內(nèi)p65 與Bcl-2 蛋白表達(dá)量明顯下降(0.28±0.06,0.28±0.04,P<0.05),而IKBα 的表達(dá)量增加明顯(0.9±0.05,P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖6 與表5。

    圖6 各組相關(guān)蛋白表達(dá)情況:A.正常胃癌細(xì)胞組;B.脂質(zhì)體組;C.空載質(zhì)粒組;D.目的質(zhì)粒組

    表5 各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平表

    3 討論

    誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物治療腫瘤的重要機(jī)制之一[7-8]。研究表明,泛素樣小分子修飾SUMO 參與了多種細(xì)胞進(jìn)程,如細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及DNA 損傷修復(fù)等[9]。SUMO是一個(gè)重要的、多步驟的蛋白質(zhì)翻譯后修飾過(guò)程,而Ubc9 在SUMO 化這一過(guò)程中至關(guān)重要,Ubc9 是SUMO 修飾過(guò)程中唯一的E2 結(jié)合酶[10],能增強(qiáng)SUMO 化修飾從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[11]。

    人類(lèi)胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)NF-κB 通路極度活躍,它可通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲等相關(guān)環(huán)節(jié)促進(jìn)癌變[12],NF-κB 是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,與炎癥、凋亡等過(guò)程密切相關(guān)。NF-κB 是普遍存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種快反應(yīng)因子,在靜息狀態(tài)下,它與抑制因子IκB 形成復(fù)合物,以無(wú)活性的潛在狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。NF-κB信號(hào)通路是由細(xì)胞外的刺激引起的,受體蛋白接受刺激后先活化IκB 激酶(IKK)。IKK 將細(xì)胞內(nèi)NFκB·IκB 復(fù)合物的IκB 亞基調(diào)節(jié)位點(diǎn)的絲氨酸磷酸化,使得IκB 亞基被泛素化修飾,進(jìn)而被蛋白酶降解,從而釋放NF-κB 二聚體[13]。p50 和p65 組成的二聚體為NF-κB 的主要形式,p50 是與DNA 結(jié)合的部位,p65 參與基因轉(zhuǎn)錄的起始調(diào)節(jié),p65 是NF-κB 的主要活性形式,并可促進(jìn)p50 與DNA 結(jié)合,當(dāng)p65 與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抑制蛋白IκB 結(jié)合,可掩蓋p50 上核定位信號(hào),僅有p65 的蛋白C 末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域,能夠直接啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄[14-15]。本研究中觀察:Ubc9 能抑制SGC7901 細(xì)胞內(nèi)的p65入核,從而抑制NF-κB 進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 特定靶кB 部位結(jié)合,進(jìn)而抑制NF-κB 的活化,同時(shí)本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)胃癌SGC7901 細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ubc9 后,與各對(duì)照組比較,Ubc9-shRNA 組IKBα 表達(dá)量增加,p65 的表達(dá)量減少(P<0.05),提示人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA 質(zhì)粒明顯能夠抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活,證實(shí)了文獻(xiàn)[13]研究結(jié)論,Ubc9 能與IKBα 結(jié)合并發(fā)生相互作用,延緩IKBα 的降解和NF-κB 的轉(zhuǎn)錄激活。

    細(xì)胞凋亡一種程序性的細(xì)胞死亡,Bcl-2 基因主要的生理功能是減少細(xì)胞凋亡[16],研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2 基因在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)。研究證實(shí),凋亡是由于caspases 家族蛋白的瀑布式反應(yīng)而導(dǎo)致的細(xì)胞自身溶解的過(guò)程,Bcl-2 蛋白不僅能抑制細(xì)胞凋亡,亦可能拮抗抑癌基因所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。作為抗凋亡蛋白,Bcl-2 蛋白能夠通過(guò)抑制腫瘤凋亡來(lái)促進(jìn)其擴(kuò)散。轉(zhuǎn)錄激活后入核的NF-κB 可調(diào)控反向凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax 及細(xì)胞增殖相關(guān)基因Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞周期的調(diào)控。在本次實(shí)驗(yàn)中,我們觀察發(fā)現(xiàn)Ubc9 轉(zhuǎn)染后胃癌SGC7901細(xì)胞的周期被阻滯在G2/M 期,并且細(xì)胞的凋亡增加明顯,NF-κB 轉(zhuǎn)錄激活后Bcl-2 水平降低,與各對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),提示Ubc9 可能是通過(guò)NF-κB 通路影響B(tài)cl-2 基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控胃癌SGC7901 細(xì)胞的凋亡。Mo 等[17]下調(diào)Ubc9 后乳腺癌MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制,凋亡增加,Ubc9 是通過(guò)Bcl-2 發(fā)揮作用,結(jié)果表明Ubc9 通過(guò)影響B(tài)cl-2 基因表達(dá)而具有抗凋亡作用。

    綜上所述,人工合成的針對(duì)Ubc9 基因的miRNA質(zhì)粒能夠抑制SGC7901 細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡,為胃癌的治療提供了一種新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。然而對(duì)于其具體的通路以及如何影響胃癌細(xì)胞周期的分子機(jī)制尚未明確。

    猜你喜歡
    泛素脂質(zhì)體細(xì)胞周期
    PEG6000修飾的流感疫苗脂質(zhì)體的制備和穩(wěn)定性
    紅霉素聯(lián)合順鉑對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響
    超濾法測(cè)定甘草次酸脂質(zhì)體包封率
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:20:08
    TPGS修飾青蒿琥酯脂質(zhì)體的制備及其體外抗腫瘤活性
    中成藥(2017年3期)2017-05-17 06:08:52
    NSCLC survivin表達(dá)特點(diǎn)及其與細(xì)胞周期的關(guān)系研究
    X線照射劑量率對(duì)A549肺癌細(xì)胞周期的影響
    蛋白泛素化和類(lèi)泛素化修飾在植物開(kāi)花時(shí)間調(diào)控中的作用
    熊果酸對(duì)肺癌細(xì)胞株A549及SPCA1細(xì)胞周期的抑制作用
    泛RNA:miRNA是RNA的“泛素”
    泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域與泛素化信號(hào)的識(shí)別
    国产高清视频在线播放一区| 99国产精品99久久久久| 亚洲美女黄片视频| 一本综合久久免费| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲七黄色美女视频| 捣出白浆h1v1| 蜜桃国产av成人99| 国产一区二区 视频在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美午夜高清在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人国产av品久久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 在线观看66精品国产| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 色综合婷婷激情| 国产成人欧美在线观看 | 欧美在线一区亚洲| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美在线黄色| 国产99久久九九免费精品| e午夜精品久久久久久久| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 天堂中文最新版在线下载| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜视频精品福利| 一区二区三区激情视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人精品一区二区免费| 欧美日韩视频精品一区| 男女免费视频国产| 久久久久精品人妻al黑| 一区福利在线观看| 久久久精品区二区三区| 成人永久免费在线观看视频 | 水蜜桃什么品种好| 真人做人爱边吃奶动态| 搡老乐熟女国产| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费观看人在逋| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲精品在线观看二区| 水蜜桃什么品种好| 色播在线永久视频| 丝袜美足系列| 一级a爱视频在线免费观看| 在线观看66精品国产| 国产在线一区二区三区精| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲欧美色中文字幕在线| 午夜福利欧美成人| 欧美日韩黄片免| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久久久免费高清国产稀缺| 日本黄色视频三级网站网址 | 丝袜在线中文字幕| 婷婷成人精品国产| 十八禁高潮呻吟视频| 少妇精品久久久久久久| 国产日韩欧美在线精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久精品人妻al黑| 极品教师在线免费播放| 亚洲av日韩在线播放| 久久99一区二区三区| 狠狠狠狠99中文字幕| 90打野战视频偷拍视频| 黄频高清免费视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 亚洲第一青青草原| 久久av网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黑丝袜美女国产一区| 天天操日日干夜夜撸| 18禁美女被吸乳视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产三级黄色录像| 捣出白浆h1v1| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 免费在线观看完整版高清| 国产在线视频一区二区| 国产av精品麻豆| 午夜成年电影在线免费观看| 一二三四社区在线视频社区8| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美在线黄色| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产高清激情床上av| 亚洲情色 制服丝袜| av国产精品久久久久影院| 亚洲专区国产一区二区| 大型黄色视频在线免费观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 黄色视频,在线免费观看| 波多野结衣一区麻豆| 欧美国产精品一级二级三级| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 日本五十路高清| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 中文欧美无线码| 中文字幕色久视频| 9色porny在线观看| av不卡在线播放| 婷婷成人精品国产| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| videosex国产| 又大又爽又粗| 欧美日韩一级在线毛片| 777米奇影视久久| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品熟女久久久久浪| 国产亚洲一区二区精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 两个人免费观看高清视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 一级,二级,三级黄色视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩免费高清中文字幕av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 十八禁网站免费在线| 女警被强在线播放| 咕卡用的链子| 国产真人三级小视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 久久ye,这里只有精品| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产一区二区三区综合在线观看| bbb黄色大片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产在线观看jvid| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 老汉色∧v一级毛片| 国产在线免费精品| 十分钟在线观看高清视频www| 欧美激情久久久久久爽电影 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 69av精品久久久久久 | 国产一区二区激情短视频| 精品久久久久久电影网| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩欧美一区视频在线观看| 香蕉国产在线看| 中文字幕高清在线视频| 国产成人系列免费观看| 久久久久国内视频| 国产1区2区3区精品| videos熟女内射| cao死你这个sao货| 久久国产精品人妻蜜桃| 99久久人妻综合| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美乱妇无乱码| 色综合婷婷激情| 久久狼人影院| 日本av免费视频播放| netflix在线观看网站| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 黑人操中国人逼视频| 亚洲国产看品久久| 制服诱惑二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产av一区二区精品久久| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产在视频线精品| 国产精品久久久人人做人人爽| av福利片在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美黄色片欧美黄色片| 夜夜夜夜夜久久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品亚洲av一区麻豆| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 大香蕉久久网| 午夜久久久在线观看| 丝袜在线中文字幕| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 大陆偷拍与自拍| 国产精品 欧美亚洲| 欧美 日韩 精品 国产| 18禁美女被吸乳视频| 黄片播放在线免费| 91成人精品电影| 最新的欧美精品一区二区| 精品高清国产在线一区| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 午夜福利欧美成人| 中文字幕人妻熟女乱码| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产一卡二卡三卡精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 五月开心婷婷网| av网站在线播放免费| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| www.熟女人妻精品国产| 久久精品国产a三级三级三级| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品电影一区二区三区 | 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲国产成人一精品久久久| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 午夜福利乱码中文字幕| 久久这里只有精品19| 亚洲午夜理论影院| 他把我摸到了高潮在线观看 | 精品一品国产午夜福利视频| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品九九99| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 午夜视频精品福利| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产不卡av网站在线观看| 操美女的视频在线观看| 另类精品久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 叶爱在线成人免费视频播放| 久久影院123| 无遮挡黄片免费观看| 国产av又大| 又黄又粗又硬又大视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人啪精品午夜网站| 嫩草影视91久久| 99riav亚洲国产免费| 又黄又粗又硬又大视频| 国产在线免费精品| 国产人伦9x9x在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 后天国语完整版免费观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩三级视频一区二区三区| 国产片内射在线| 在线观看人妻少妇| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av免费在线观看网站| 午夜福利在线免费观看网站| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产欧美亚洲国产| 在线播放国产精品三级| 午夜福利视频在线观看免费| 久久香蕉激情| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 丰满饥渴人妻一区二区三| 满18在线观看网站| 中文字幕高清在线视频| 男女床上黄色一级片免费看| 夫妻午夜视频| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 中文字幕高清在线视频| 99国产精品免费福利视频| 夫妻午夜视频| 国产成人系列免费观看| 国产麻豆69| 999精品在线视频| 夜夜爽天天搞| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 免费少妇av软件| 一区二区av电影网| 999精品在线视频| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩av久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品熟女少妇八av免费久了| 中文字幕精品免费在线观看视频| 两个人免费观看高清视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产日韩欧美亚洲二区| 免费在线观看黄色视频的| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲黑人精品在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产免费现黄频在线看| 日日夜夜操网爽| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 高清av免费在线| 无遮挡黄片免费观看| 精品国产一区二区久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产av又大| 亚洲欧美激情在线| 久久免费观看电影| 久久久久网色| 天堂中文最新版在线下载| 久久精品国产综合久久久| 亚洲中文av在线| 黄色怎么调成土黄色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 正在播放国产对白刺激| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产精品一区二区精品视频观看| 国产免费福利视频在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品.久久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 久久中文看片网| 正在播放国产对白刺激| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久久视频综合| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 狂野欧美激情性xxxx| 91成人精品电影| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 999久久久国产精品视频| 男人操女人黄网站| 黄色 视频免费看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 中文亚洲av片在线观看爽 | 欧美大码av| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 久久久精品免费免费高清| 国产精品免费大片| 男女无遮挡免费网站观看| 精品午夜福利视频在线观看一区 | 黄色片一级片一级黄色片| 老汉色∧v一级毛片| 免费av中文字幕在线| 国产主播在线观看一区二区| www.精华液| 国产高清激情床上av| 国产成人啪精品午夜网站| av欧美777| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲综合色网址| 99re在线观看精品视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品视频人人做人人爽| √禁漫天堂资源中文www| 国产主播在线观看一区二区| 成人18禁在线播放| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品影院久久| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日本五十路高清| 操美女的视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 99热国产这里只有精品6| 亚洲专区中文字幕在线| 国产麻豆69| 97在线人人人人妻| 桃花免费在线播放| 天天影视国产精品| 国产区一区二久久| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 老司机福利观看| 男女无遮挡免费网站观看| 国产成人啪精品午夜网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久人妻av系列| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 丁香六月欧美| 天天添夜夜摸| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品熟女久久久久浪| 99国产精品一区二区蜜桃av | 一进一出好大好爽视频| 最新美女视频免费是黄的| 国产精品二区激情视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 在线观看舔阴道视频| 五月开心婷婷网| 9191精品国产免费久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 9热在线视频观看99| 久久精品成人免费网站| 在线观看www视频免费| 国产欧美日韩一区二区精品| av线在线观看网站| 老司机午夜福利在线观看视频 | e午夜精品久久久久久久| 波多野结衣av一区二区av| 大码成人一级视频| 久久亚洲精品不卡| av天堂久久9| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产亚洲欧美在线一区二区| 日韩免费高清中文字幕av| 国产成人精品久久二区二区91| 国产精品1区2区在线观看. | 在线av久久热| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 成人影院久久| 久久久久精品人妻al黑| 99九九在线精品视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 欧美日韩av久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 少妇粗大呻吟视频| 桃花免费在线播放| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 人成视频在线观看免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产成人av教育| 少妇精品久久久久久久| 一级毛片电影观看| 香蕉丝袜av| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 精品亚洲成a人片在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 黄色成人免费大全| 亚洲av第一区精品v没综合| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 色94色欧美一区二区| av国产精品久久久久影院| 18禁国产床啪视频网站| 久久久国产一区二区| 丁香六月天网| 视频区图区小说| 999久久久精品免费观看国产| 高清黄色对白视频在线免费看| 丝袜美足系列| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品一区二区在线不卡| 亚洲第一av免费看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 精品免费久久久久久久清纯 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 黄色视频,在线免费观看| 成人精品一区二区免费| 深夜精品福利| 久久人妻av系列| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产日韩欧美在线精品| 少妇的丰满在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲伊人久久精品综合| 日韩欧美国产一区二区入口| 免费在线观看黄色视频的| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 97在线人人人人妻| 精品一区二区三区四区五区乱码| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 十八禁人妻一区二区| 丝袜美足系列| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| av一本久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看 | 久久久久久人人人人人| 两性夫妻黄色片| 妹子高潮喷水视频| 一区在线观看完整版| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 不卡av一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久国产精品大桥未久av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产精品二区激情视频| 搡老乐熟女国产| 宅男免费午夜| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩三级视频一区二区三区| 精品少妇内射三级| 欧美激情高清一区二区三区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产三级黄色录像| 久久国产亚洲av麻豆专区| 波多野结衣av一区二区av| 成人国语在线视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 丁香六月天网| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产精品免费大片| 久久久欧美国产精品| 老司机福利观看| 午夜福利视频在线观看免费| 免费不卡黄色视频| 99久久人妻综合| 亚洲国产av影院在线观看| 日韩免费av在线播放| 女警被强在线播放| 男人舔女人的私密视频| bbb黄色大片| 丝瓜视频免费看黄片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 视频区图区小说| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 一区二区av电影网| 91成人精品电影| 777米奇影视久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美一级毛片孕妇| avwww免费| 欧美精品av麻豆av| 18禁国产床啪视频网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产在线视频一区二区| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久中文字幕人妻熟女| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲欧美激情在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 91成人精品电影| 成人三级做爰电影| 1024香蕉在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久性视频一级片| 国产一区有黄有色的免费视频| 黄色怎么调成土黄色| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久久久国产电影| 免费av中文字幕在线| 天天添夜夜摸| 热re99久久精品国产66热6| 十分钟在线观看高清视频www| 一本一本久久a久久精品综合妖精| av不卡在线播放| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产高清激情床上av| 精品国产国语对白av| 日韩大码丰满熟妇| tube8黄色片| av国产精品久久久久影院| 久久久久久久久久久久大奶| 日韩欧美国产一区二区入口| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产有黄有色有爽视频| 婷婷成人精品国产| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲熟女毛片儿| 欧美一级毛片孕妇| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费在线观看完整版高清| 老司机亚洲免费影院| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一进一出好大好爽视频| 老司机深夜福利视频在线观看| av福利片在线| 国产精品国产av在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av视频免费观看在线观看| 一本久久精品| 欧美精品一区二区免费开放| 成年动漫av网址| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久九九热精品免费| av欧美777| 咕卡用的链子| 国产欧美日韩一区二区精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日韩福利视频一区二区| kizo精华| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一区二区av电影网| 99精品欧美一区二区三区四区| 国产老妇伦熟女老妇高清| 精品久久久久久电影网| 天堂动漫精品| 午夜激情av网站| 欧美黄色淫秽网站| 国产亚洲欧美在线一区二区|