脫水對(duì)栓皮櫟種子基因表達(dá)的影響1)

李東興 錢家連 許慧慧 張國(guó)偉 任俊杰 王茜 許洋 王利兵 于海燕 李迎超

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京，100091) (河北省洪崖山國(guó)有林場(chǎng))(河北邢臺(tái)市信都區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局) (中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所)

栓皮櫟(Quercusvariabilis)為殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)落葉喬木，耐貧瘠和干旱，是營(yíng)造防護(hù)林、水源涵養(yǎng)林和防風(fēng)林的優(yōu)良樹種，具有較高的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值[1-2]。栓皮櫟樹皮也稱軟木，作為一種可再生的生物質(zhì)材料，被廣泛用于葡萄酒瓶塞和保溫隔熱等諸多領(lǐng)域[3]；栓皮櫟種子中營(yíng)養(yǎng)豐富，淀粉含量高，可用于釀酒和提取漿紗，也是生產(chǎn)燃料乙醇的“非糧”原料[2]。同時(shí)，栓皮櫟殼斗也是制備活性炭和糖醛等的優(yōu)質(zhì)原料。

然而，絕大多數(shù)櫟屬植物無(wú)性繁殖困難[4-5]，其苗木繁育主要依靠播種[6]，種子質(zhì)量決定了成活率及苗木質(zhì)量。櫟屬植物種子成熟后期都不經(jīng)歷成熟干燥后獲得脫水耐性的過(guò)程，這導(dǎo)致它們對(duì)脫水敏感[7]。栓皮櫟種子是典型的脫水敏感頑拗性種子，其成熟脫落時(shí)含水量高，干燥后在低溫(-18℃左右)環(huán)境中貯藏的常規(guī)方法會(huì)使種子迅速失去活力，進(jìn)而死亡[8-9]。頑拗性種子脫水敏感性是植物重要的功能特征和由多基因共同響應(yīng)的次級(jí)進(jìn)化[10-11]。種子脫水過(guò)程中，細(xì)胞感受到水分流失信號(hào)，信號(hào)經(jīng)傳導(dǎo)后，在轉(zhuǎn)錄和翻譯等不同水平上做出響應(yīng)，以調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)和蛋白合成，應(yīng)對(duì)脫水造成的傷害。頑拗性種子脫水過(guò)程中，與轉(zhuǎn)錄因子(MYB1R1、ERF106、ABI3、RL40和TGA10)、激素信號(hào)傳導(dǎo)(PP2C、JAZ1、JAZ2和JAZ3)和抗氧化酶(SUPEROXIDE DISMUTASE和CATALASE)相關(guān)的基因差異表達(dá)，它們可能在種子脫水響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用，參與種子脫水敏感性的分子調(diào)控[13-15]。不同頑拗性種子脫水敏感性不盡相同[16-17]，其調(diào)控機(jī)制也不相同。雖然已有研究對(duì)栓皮櫟頑拗性種子脫水敏感性進(jìn)行探究，指出種子最佳貯藏溫度為(0～2)℃[8]，但是種子脫水敏感性分子調(diào)控機(jī)制在很大程度上仍然是未知的。

因此，本研究以從同一栓皮櫟優(yōu)良單株上收集的種子為試驗(yàn)材料，進(jìn)行脫水和萌發(fā)試驗(yàn)，然后對(duì)脫水敏感關(guān)鍵時(shí)期的種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)獲得差異表達(dá)基因的功能和其參與的代謝通路進(jìn)行分析，篩選種子脫水敏感性的候選基因，分析其可能的調(diào)控作用。以期為栓皮櫟種子脫水敏感性分子調(diào)控機(jī)制的研究提供參考，也為其苗木繁育、種子貯藏與種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

供試種子來(lái)源于陜西省周至縣樓觀臺(tái)林場(chǎng)中的同一栓皮櫟優(yōu)良單株，2019年9月中旬獲得種子后，首先通過(guò)目視法手工去除雜質(zhì)和肉眼可見的劣質(zhì)種子，然后用55 ℃溫水浸泡水選，5 min后所有仍然漂浮在水面上的種子被丟棄[18]，剩下的種子經(jīng)瀝水且用濾紙擦干表面水分后，平鋪在陰涼處陰干(12～15 h)。在此期間，每隔2～3 h翻動(dòng)1次種子。陰干完成后，挑選健康、均勻且沒有萌發(fā)的種子，在國(guó)家林業(yè)和草原局北方林木種子檢驗(yàn)中心內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1 脫水試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照程繼銘等[19]的方法，采用硅膠快速脫水法進(jìn)行脫水試驗(yàn)。脫水處理梯度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 d(T1～T15)，共15個(gè)處理，以不經(jīng)脫水處理的種子為對(duì)照(CK)。每個(gè)處理均隨機(jī)挑選45粒種子，重復(fù)3次，共135粒種子，分別置于裝有硅膠的大號(hào)自封袋中(m(種子)∶m(硅膠)=1∶3)，混合均勻后，在室溫約25 ℃，相對(duì)濕度為40%～45%的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行脫水試驗(yàn)。到達(dá)預(yù)脫水時(shí)間后，每個(gè)處理分別隨機(jī)取100粒種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，30(每組10粒分3組)粒種子經(jīng)液氮速凍后，迅速放置于冰箱里-80 ℃儲(chǔ)存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2 種子含水量測(cè)定

參照GB 2772—1999《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》，采用稍加改進(jìn)后的低恒溫烘干法測(cè)定種子初始含水量(CIM)。首先將樣品盒和蓋烘干至恒質(zhì)量后，把種子迅速切成片狀放入樣品盒中，然后在103 ℃的烘箱中烘17 h(達(dá)到預(yù)設(shè)溫度后開始計(jì)時(shí))。3次重復(fù)，每次重復(fù)10粒種子，CIM按照以下公式計(jì)算：

CIM=((L-N)/(L-P))×100%。

式中：L為樣品盒和蓋以及樣品的烘前質(zhì)量(g)；N為樣品盒和蓋以及樣品的烘后質(zhì)量(g)；P為樣品盒和蓋的質(zhì)量(g)。

不同脫水處理后種子含水量用種子初始含水量減去脫水量計(jì)算得到。

1.3 萌發(fā)試驗(yàn)

選擇直徑為12 cm的培養(yǎng)皿，雙層濾紙加一層紗布做為發(fā)芽床，然后置于光暗周期為30 ℃光照8 h，20 ℃黑暗16 h的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)[20]，5次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20粒種子。以胚根露出至少2 mm作為萌發(fā)標(biāo)志[21]，每天觀察并記錄1次萌發(fā)情況，萌發(fā)持續(xù)時(shí)間為28 d[22]。種子萌發(fā)率(PG)按照以下公式計(jì)算：

式中：Dt表示在t日時(shí)的萌發(fā)數(shù)量；N表示種子總數(shù)。

1.4 種子總RNA提取、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析

用Trizol試劑(Invitrogen,CA,USA)提取栓皮櫟種子總RNA后，分別用Agilent 2100 Bioanalyzer和RNA 6000 Nano LabChip Kit(Agilent,CA,USA)檢測(cè)所提樣品RNA的質(zhì)量和純度。樣品合格后在杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司Iilumina測(cè)序平臺(tái)(Illumina HiSeqTM4000)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。然后使用Cutadapt軟件對(duì)測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，過(guò)濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù)，接著用HISAT2將獲得的有效數(shù)據(jù)與參考基因組[23]比對(duì)。使用edgeR對(duì)String Tie組裝和定量完的基因進(jìn)行差異分析，獲得差異表達(dá)基因(DEGs)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并以P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選差異表達(dá)基因顯著富集到的GO類別和KEGG代謝途徑。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

為驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果的準(zhǔn)確性，選擇4個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。使用PrimeScriptTMReagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一條鏈的cDNA。然后按照制造商的說(shuō)明，用KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix(KapaBiosystems,USA)進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。使用NCBI上的Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，引物序列如表1所示，以PP2A[24]為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[25]。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)率變化

隨著脫水時(shí)間的延長(zhǎng)，栓皮櫟種子含水量和萌發(fā)率呈現(xiàn)出一直降低的趨勢(shì)(圖1)。未經(jīng)脫水處理種子的萌發(fā)率及含水量分別為84.00%和34.27%，脫水12 d(T12)后，種子萌發(fā)率降為0，此時(shí)種子含水量為17.17%。脫水初期(CK～T2)種子萌發(fā)率下降最快；經(jīng)過(guò)一個(gè)較慢的下降階段后(T2～T4)，萌發(fā)率又迅速下降(T4～T6)，最后緩慢降至0。此外，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明栓皮櫟種子含水量與萌發(fā)率間存在極顯著的正相關(guān)(P<0.01,R=0.976)，這說(shuō)明其對(duì)水分流失高度敏感。此外，臨界含水量和致死含水量分別指50%左右和全部種子無(wú)法存活時(shí)的含水量，能夠作為頑拗性種子脫水敏感性的標(biāo)準(zhǔn)[26-27]。本研究中，當(dāng)栓皮櫟種子含水量低于28.20%(T2)時(shí)，近一半種子失去生活力，即栓皮櫟種子臨界含水量可能在28.20%左右；當(dāng)種子含水量低于17.79%(T11)時(shí)，種子基本全部失去生活力，即種子致死含水量可能在17.79%左右。因此，為探究栓皮櫟種子脫水過(guò)程中的基因表達(dá)變化，我們對(duì)未脫水、脫水2 d和11 d的栓皮櫟種子樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

豎線表示均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

T11、T2和CK3個(gè)時(shí)期栓皮櫟種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明共得到了475 939 682條原始序列，過(guò)濾掉帶接頭(Adaptor)、含有N(N表示無(wú)法確定堿基信息)的比例大于5%和低質(zhì)量(質(zhì)量值Q≤10的堿基數(shù)占整個(gè)序列的20%以上)的讀取片段后，共得到450 383 524條有效序列。它們的GC含量和Q30的值分別是43.50%～44.00%和98.05%～98.28%(表2)。與參考基因組(GCF_002906115.1)比對(duì)后，86.73%～88.33%的測(cè)序片段能夠比對(duì)到參考基因組上，而且51.03%～52.61%的片段能唯一比對(duì)到參考基因組一個(gè)位置上。這些結(jié)果表明了本次測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，能夠進(jìn)行后續(xù)差異表達(dá)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.3 差異表達(dá)基因的鑒定

對(duì)栓皮櫟種子轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。最終，以基因差異表達(dá)倍數(shù)≥1并且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在T2與CK比較組中獲得4 405個(gè)差異表達(dá)基因，包括2 724個(gè)上調(diào)和1 681個(gè)下調(diào)基因；在T11與T2比較組里鑒定出1 765個(gè)上調(diào)和2 301個(gè)下調(diào)，共4 066個(gè)差異表達(dá)基因；有3 208個(gè)上調(diào)和2 699個(gè)下調(diào)，共5 907個(gè)差異表達(dá)基因，在比較組T11與CK中被獲得(表3)。這些差異表達(dá)基因可能在栓皮櫟頑拗性種子脫水過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與其脫水敏感性密切相關(guān)。

表3 不同比較組差異表達(dá)基因數(shù)

2.4 差異表達(dá)基因的GO和KEGG分析

基因本體論(GO)分析能夠全面描述生物體中基因?qū)傩?，其總共?個(gè)主要類別，分別描述基因的分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過(guò)程。如圖2所示，在3個(gè)比較組中，上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因均主要富集在“防御反應(yīng)”、“轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA模板”和“氧化還原過(guò)程”等生物學(xué)過(guò)程類別；“細(xì)胞核”、“細(xì)胞質(zhì)”和“質(zhì)膜”等細(xì)胞組分類別以及“蛋白結(jié)合”、“ATP結(jié)合”和“DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性”等分子功能類別中。

圖2 差異表達(dá)基因的GO富集分析

生物體內(nèi)，不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能，基于途經(jīng)的分析有助于更進(jìn)一步了解基因的生物學(xué)功能。本研究對(duì)獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在比較組T2與CK中，上調(diào)的差異表達(dá)基因顯著富集在“蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工”和“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”等途徑；“異黃酮生物合成”、“谷胱甘肽生物合成”和“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”等是T11與T2中顯著富集的通路；“谷胱甘肽生物合成”和“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”等代謝途徑在T11與CK中顯著富集(圖3)。比較組T2與CK中，下調(diào)的差異表達(dá)基因在“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”和“MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)”等途徑中顯著富集；“其它多糖降解”和“檸檬烯和蒎烯降解”等途徑是T11與T2中顯著富集的通路；T11與CK中，“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”和“淀粉和蔗糖代謝”等是差異表達(dá)基因顯著富集的通路(圖3)。這些代謝通路有助于了解栓皮櫟種子應(yīng)對(duì)脫水時(shí)的代謝信息，以便更好地探究其脫水敏感性的潛在調(diào)控機(jī)制。

2.5 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脫水的響應(yīng)

本研究中，我們?cè)诒容^組T2與CK、T11與T2和T11與CK分別發(fā)現(xiàn)117、110和183個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因(表4)。其中，MYB108(LOC112035993)、MYB1R1(LOC111996955)、WRKY28(LOC111998523)、WRKY72(LOC111987575)和ERF1B(LOC111996147)等14個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)持續(xù)上調(diào)；UNE10(LOC112020213)和CRF4(LOC112020213)等5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)持續(xù)下調(diào)；ABI3(LOC112020213)、NGA1(LOC112036666)和RAP2-11(LOC112003881)等10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)；轉(zhuǎn)錄因子MYB102(LOC111989495)和SRM1(LOC112023214)表達(dá)先下調(diào)后上調(diào)(表5、圖4)。

表4 與轉(zhuǎn)錄因子和Ca2+途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因

2.6 Ca2+途徑對(duì)脫水的響應(yīng)

本研究中，我們?cè)诒容^組T2與CK、T11與T2和T11與CK分別發(fā)現(xiàn)12、4和13個(gè)與Ca2+途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因(表4)。其中，有3個(gè)基因在3個(gè)比較組中均差異表達(dá)。鈣調(diào)蛋白11(LOC111999077)表達(dá)持續(xù)上調(diào)；鈣調(diào)蛋白3(LOC112017550)表達(dá)先上調(diào)后下調(diào)；鈣調(diào)蛋白(LOC111983139)表達(dá)先下調(diào)后上調(diào)(圖5)。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

表5 與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異表達(dá)基因

圖4 與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的差異表達(dá)基因熱圖

圖5 與Ca2+途徑相關(guān)的差異表達(dá)基因熱圖

2.7 與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的DEGs

脫水2 d后，我們發(fā)現(xiàn)與茉莉酸(JA)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，編碼茉莉酸—氨基酸合成酶的1個(gè)JAR1、茉莉酮酸酯ZIM結(jié)構(gòu)域蛋白的2個(gè)JAZ、髓細(xì)胞組織增生蛋白(MYCs)的4個(gè)基因表達(dá)均上調(diào)；在比較組T11與T2中，2個(gè)JAZ基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)JAZ和5個(gè)MYC2基因表達(dá)下調(diào)(圖6A；圖7A和B)。此外，我們同樣發(fā)現(xiàn)脫水2 d后，與水楊酸(SA)信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，編碼TGACG基序結(jié)合因子的4個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；在比較組T11與T2中，1個(gè)TGA基因表達(dá)下調(diào)，1個(gè)編碼病程相關(guān)蛋白1的基因表達(dá)上調(diào)(圖6B；圖7A和B)。比較組T11與CK中，與JA和SA信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的DEGs最多(圖7C)。

A顯示了茉莉酸信號(hào)傳導(dǎo)的途徑；B顯示了水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)的途徑。圓圈代表代謝產(chǎn)物，方框代表調(diào)節(jié)基因。紅色表示基因表達(dá)上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)，橘色表示該基因家族中既有上調(diào)基因又有下調(diào)基因。

A代表T2與CK;B代表T11與T2;C代表T11與CK。

2.8 qRT-PCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，我們對(duì)4個(gè)DEGs進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。盡管表達(dá)量并非完全一樣，但是它們的表達(dá)趨勢(shì)基本一致(表6)。這說(shuō)明本研究RNA-Seq結(jié)果是可靠的，能夠進(jìn)行后續(xù)的差異表達(dá)分析。

表6 對(duì)4個(gè)DEGs的qRT-PCR驗(yàn)證

3 結(jié)論與討論

頑拗性種子脫水后，測(cè)定含水量和萌發(fā)率是研究種子頑拗性的常用方法[19]。與我們的預(yù)期一樣，栓皮櫟種子萌發(fā)率隨著含水量的下降而下降，并且含水量與萌發(fā)率之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)(P<0.01,R=0.976)，相同的結(jié)果在其它頑拗性種子的研究中也被得到證實(shí)[12-13，20]。本研究中，栓皮櫟種子含水量由34.27%(CK)下降到28.20%(T2)時(shí)，近一半的種子已喪失生命力，此時(shí)種子已受到嚴(yán)重的傷害。此外，當(dāng)栓皮櫟種子含水量從34.27%(CK)下降到17.17%(T11)時(shí)，種子幾乎完全失去生命力，這與Yu et al.[28]對(duì)頑拗性七葉樹(Aesculuschinensis)種子的研究類似。

植物中參與調(diào)控脅迫誘導(dǎo)型基因表達(dá)的各類轉(zhuǎn)錄因子，尤其是MYB、WRKY、AP2-EREBP和bHLH等轉(zhuǎn)錄因子家族，是信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[29-30]。山茶(Camelliasinensis)種子脫水過(guò)程中，差異表達(dá)的MYB、WRKY和bHLH等轉(zhuǎn)錄因子家族基因可能參與種子脫水敏感性調(diào)控[12]。本研究中，4個(gè)MYB、5個(gè)WRKY、3個(gè)ERF和2個(gè)HSF類轉(zhuǎn)錄因子在栓皮櫟種子脫水過(guò)程中持續(xù)上調(diào)。轉(zhuǎn)錄因子MYB108是ABA誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)控因子，能夠調(diào)節(jié)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，還可能在轉(zhuǎn)錄水平上參與JA的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控多種脅迫反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)[31-32]。頑拗性種子脫水過(guò)程中，ROS的積累是其不耐脫水的原因之一[26]。栓皮櫟種子脫水過(guò)程中，持續(xù)上調(diào)的MYB108可能增強(qiáng)了ROS的產(chǎn)生，使種子受到脫水傷害。與頑拗性桑寄生(Taxillusichinensis)種子[13]不同，栓皮櫟種子脫水過(guò)程中MYB1R1表達(dá)持續(xù)上調(diào)，這可能是因?yàn)椴煌B拗性種子對(duì)脫水響應(yīng)不同。轉(zhuǎn)錄因子ERF1B能夠調(diào)控?cái)M南芥(Arabidopsisthaliana)中JA響應(yīng)基因，并作用于JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑下游[33]，參與植物對(duì)脅迫的響應(yīng)。栓皮櫟種子脫水過(guò)程中，持續(xù)上調(diào)的ERF1B轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)控激素信號(hào)傳導(dǎo)中相關(guān)基因的表達(dá)，在種子對(duì)脫水的響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。此外，我們同樣發(fā)現(xiàn)2個(gè)ERF類轉(zhuǎn)錄因子在栓皮櫟種子脫水過(guò)程中持續(xù)下調(diào)。CRF轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的基因表達(dá)[34]，持續(xù)下調(diào)的CRF4轉(zhuǎn)錄因子可能干擾了栓皮櫟種子中脅迫信號(hào)的傳遞，細(xì)胞中防御機(jī)制無(wú)法啟動(dòng)，受損程度不斷加深，進(jìn)而導(dǎo)致種子對(duì)脫水敏感。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子能增強(qiáng)細(xì)胞清除ROS的能力，降低氧化應(yīng)激對(duì)植物造成的傷害，提高對(duì)非生物脅迫耐受性[35]。擬南芥中過(guò)表達(dá)的AtUNE12基因使其能快速清除ROS，減少脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞損傷[36]。我們發(fā)現(xiàn)UNE10、HEC1-like和bHLH94-like，3個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因在栓皮櫟種子脫水過(guò)程中持續(xù)下調(diào)，推測(cè)這可能使種子清除ROS的能力下降，過(guò)量積累的ROS使細(xì)胞損傷程度不斷加深，進(jìn)而導(dǎo)致種子對(duì)脫水敏感。

植物對(duì)各種脅迫因子的響應(yīng)中，Ca2+作為關(guān)鍵的第二信使，傳遞脅迫信號(hào)，引發(fā)細(xì)胞的防御反應(yīng)，Ca2+結(jié)合蛋白(CMLs)對(duì)Ca2+信號(hào)傳遞至關(guān)重要[37]。CML37能通過(guò)影響茉莉酸—異亮氨酸綴合物的合成，進(jìn)而將Ca2+和JA信號(hào)連接起來(lái)，CML37基因突變體中，JAR1表達(dá)降低，JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑受到干擾[38]。本研究中，CML11在種子脫水過(guò)程中持續(xù)上調(diào)，這可能影響了Ca2+和JA信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致種子不耐脫水。

植物感受到環(huán)境脅迫信號(hào)后，體內(nèi)會(huì)大量合成JA。JA在腺苷酸形成酶的催化下形成高生物活性的JA-Ile，它能與JA受體COIl特異性結(jié)合為COIl-JA-Ile復(fù)合物，然后通過(guò)招募JAZ形成COI1-JA-Ile-JAZ三元復(fù)合體，解除對(duì)下游MYC2等轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，激活JA響應(yīng)基因的表達(dá)[39-40]。本研究中，脫水2 d后，JAR1,JAZ和MYC2基因表達(dá)上調(diào)，這與Luo et al.[41]對(duì)棉花(Gossypiumspp.)的研究有些類似。JAR1基因的上調(diào)可能促進(jìn)了COI1-JA-Ile-JAZ復(fù)合物的形成，解除JAZ對(duì)MYC2的抑制作用，上調(diào)的MYC2通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)響應(yīng)種子脫水。擬南芥脫水過(guò)程中。MYC2基因的顯著下調(diào)可能是JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，下游基因不表達(dá)的原因[42]。當(dāng)種子繼續(xù)脫水時(shí)，編碼JAZ的基因表達(dá)失衡，MYC2基因表達(dá)下調(diào)。這可能導(dǎo)致某些下游脅迫響應(yīng)基因在栓皮櫟種子繼續(xù)脫水時(shí)不表達(dá)，使種子受到嚴(yán)重傷害。JA和SA能相互串?dāng)_，共同調(diào)控多種信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而調(diào)控植物防御反應(yīng)[43]。植物感受到脅迫信號(hào)時(shí)，SA能和NON-EXPRESSER OF PATHOGENESIS-RELATED GENES 1(NPR1)結(jié)合[44]，影響NPR1結(jié)構(gòu)域變化，誘導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄。NPR1與bZIP類轉(zhuǎn)錄因子TGA家族和熱休克轉(zhuǎn)錄因子HSFA1間均存在互作關(guān)系，進(jìn)而在植物對(duì)SA信號(hào)的響應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)控作用[45-46]。栓皮櫟種子脫水過(guò)程中，水分流失誘導(dǎo)SA信號(hào)通路中TGA相關(guān)基因表達(dá)失衡，既有上調(diào)也有下調(diào)，這表明TGA對(duì)栓皮櫟種子響應(yīng)脫水中SA信號(hào)的調(diào)控作用不同。擬南芥II類TGA，即tga2、tga5和tga6突變體中，SA下游的PR1基因表達(dá)量比野生型高，其負(fù)調(diào)控SA下游基因，但該突變體中SA誘導(dǎo)PR1表達(dá)能力喪失，植物不能產(chǎn)生SAR[46]。當(dāng)水分繼續(xù)流失時(shí)，TGA基因表達(dá)下調(diào)，PR-1基因表達(dá)上調(diào)，其可能通過(guò)調(diào)控下游脅迫相關(guān)基因，在栓皮櫟種子應(yīng)對(duì)嚴(yán)重水分流失過(guò)程中發(fā)揮作用。因此，我們推測(cè)脫水誘導(dǎo)栓皮櫟頑拗性種子中JA和SA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的變化是其脫水敏感性的潛在調(diào)控機(jī)制。

綜上所述，栓皮櫟頑拗性種子脫水過(guò)程中，MYB108、MYB1R1、ERF1B、UNE10、CRF4、CML11、JAZ、MYC2和TGA等轉(zhuǎn)錄因子及Ca2+、JA和SA信號(hào)相關(guān)的基因差異表達(dá)。它們可能參與栓皮櫟種子脫水過(guò)程中ROS的產(chǎn)生和清除，以及脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程，進(jìn)而在種子脫水敏感性的調(diào)控中發(fā)揮作用。本研究為栓皮櫟種子脫水敏感性分子調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，有助于種子貯藏和種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存，同時(shí)也能為其它頑拗性種子的研究提供一定參考。