響應(yīng)面法優(yōu)化白芷中歐前胡素的提取工藝*

黃 瓊, 李媛媛, 石錦峰, 許錦濤, 董自波,2

白芷為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根, 性溫、 味辛,歸胃、 大腸、 肺經(jīng), 具有治療風(fēng)寒頭痛、 鼻淵、 鼻塞、 消腫排膿等功效[1]。 文獻(xiàn)報(bào)道其有效鎮(zhèn)痛成分主要為歐前胡素、 異歐前胡素等香豆素類[2]。 2020 年版《中國(guó)藥典》評(píng)價(jià)白芷質(zhì)量以歐前胡素為指標(biāo), 白芷所含歐前胡素的總量不得少于0.080%。但歐前胡素具有熱不穩(wěn)定性, 不同提取條件對(duì)歐前胡素提取率影響較大, 故本研究通過(guò)HPLC 法測(cè)定歐前胡素的含量[3-5],在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定影響歐前胡素提取率的三水平三因素, 通過(guò)Box-Behnken Design 響應(yīng)面法優(yōu)化白芷中歐前胡素的提取工藝, 以期為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀 器

JJ444BC 型電子分析天平, 上海賽多利斯貿(mào)易有限公司;ZNCL-GS 智能磁力攪拌器, 上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司;Mettler Toledo AL104 電子天平, 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 試劑與藥物

白芷, 安徽省亳州市藥材總公司中西藥公司; 歐前胡素對(duì)照品, 中國(guó)食品藥品檢定研究院; 磷酸(批號(hào): 20200805), 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 甲醇和乙腈, 上海麥克林生化科技公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 歐前胡素的HPLC 法測(cè)定

2.1.1 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm); 流動(dòng)相: 乙腈-0.1%磷酸水溶液(60∶40); 體積流量: 1.0 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng): 254 nm; 進(jìn)樣量: 20 μL。 理論塔板數(shù)按歐前胡素峰計(jì)不低于5000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱量歐前胡素對(duì)照品15 mg, 置于50 mL 棕色的量瓶中, 加甲醇溶解后, 定容至刻度線, 搖勻, 再精密移取5 mL至25 mL 的容量瓶中, 加甲醇溶解后, 定容至刻度, 搖勻, 得對(duì)照品溶液, 封口膜封口, 4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

精密量取水提液10 mL, 置具塞錐形瓶中, 精密加入甲醇10 mL, 搖勻, 濾過(guò), 用0.45 μm 的微孔濾膜濾過(guò)得續(xù)濾液,即為供試品溶液。

2.1.4 專屬性試驗(yàn)

精密吸取甲醇溶液(陰性對(duì)照溶液)、 歐前胡素對(duì)照品溶液和水提液供試品溶液各20 μL, 分別進(jìn)樣, 結(jié)果見(jiàn)圖1 ～圖3。譜圖顯示供試品與對(duì)照品溶液在相同的保留時(shí)間處有對(duì)應(yīng)的色譜峰, 且陰性對(duì)照溶液與供試品溶液、 對(duì)照品溶液在相同的保留時(shí)間處無(wú)對(duì)應(yīng)的色譜峰, 表明專屬性較強(qiáng)。

圖1 白芷供試品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of the solution of the test substance of Angelica dahurica

圖2 歐前胡素對(duì)照品溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of imperatorin reference substance solution

圖3 陰性對(duì)照溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of negative control solution

2.1.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1.2” 項(xiàng)下配制的對(duì)照品溶液各0.1、0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0 mL 置于1 mL 量瓶中, 即分別稀釋10、 5、 2.5、 1.67、 1.25、 1 倍, 加甲醇稀釋至刻度, 搖勻,得稀釋后的5 份對(duì)照品溶液, 按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定, 記錄峰面積積分值, 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X), 對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)(Y), 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 建立得出回歸方程, 歐前胡素回歸方程為Y=133090.999X+1413.311, R2=0.9998,線性范圍6.106 ～48.848 μg/mL。

2.1.6 精密度試驗(yàn)

按“2.1.2” 項(xiàng)下方法制備一份對(duì)照品溶液, 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定, 連續(xù)平行進(jìn)樣6 次, 測(cè)定對(duì)照品中歐前胡素的峰面積, 記錄色譜圖中的積分值。 峰面積積分值RSD 為0.37%＜5%, 結(jié)果說(shuō)明儀器精密度良好, 符合要求。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備一份供試品溶液, 于處理后0、2、 4、 6、 8、 12、 24 h 分別進(jìn)樣測(cè)定, 按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定, 測(cè)定不同處理時(shí)間的歐前胡素峰面積, 記錄色譜圖中的積分值。 結(jié)果歐前胡素峰面積RSD 值為0.12%, 表明在24 h 內(nèi), 供試品溶液穩(wěn)定性良好, 符合要求。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備一份供試品溶液, 按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定, 連續(xù)平行進(jìn)樣6 次, 測(cè)定供試品中歐前胡素的峰面積, 記錄色譜圖中的積分值。 峰面積RSD 為0.19%＜5%, 結(jié)果說(shuō)明說(shuō)明該方法重復(fù)性良好, 符合要求。

2.1.9 回收率試驗(yàn)

精密量取同一批水提液6 份, 每份10 mL, 分別精密加入對(duì)照品歐前胡素相當(dāng)于樣品中歐前胡素含量的100%, 按“2.3.2” 項(xiàng)下方法, 制備供試品溶液, 按“2.3.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率, 歐前胡素平均加樣回收率分別為97.13%, RSD 為0.59%, 表明此方法的準(zhǔn)確度良好。

2.2 水提取工藝的單因素考察

白芷采用水提法, 以歐前胡素提取率為指標(biāo), 考察加熱溫度、 料液比、 提取時(shí)間三個(gè)因素因素對(duì)提取結(jié)果的影響[6]。

2.2.1 提取溫度的考察

稱取白芷飲片30 g, 置于圓底燒瓶中, 加10 倍量的水, 加熱溫度分別為40、 50、 60、 70、 80 ℃, 水浴加熱提取1.5 h,提取1 次, 各平行3 份, 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定, 分別進(jìn)樣, 記錄色譜圖。采用外標(biāo)法計(jì)算歐前胡素提取率, 結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同提取溫度對(duì)歐前胡素提取率的影響Fig.4 The effect of different extraction temperatures on the extraction rate of imperatorin

2.2.2 料液比的考察

稱取白芷飲片30 g, 置圓底燒瓶中, 分別加6、 8、 10、12、 15 倍水, 60 ℃水浴加熱回流提取1 h, 提取1 次, 各平行3 份, 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定, 分別進(jìn)樣, 記錄色譜圖。 采用外標(biāo)法計(jì)算歐前胡素提取率, 結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同料液比對(duì)歐前胡素提取率的影響Fig.5 The effect of different material-to-liquid ratios on the extraction rate of imperatorin

2.2.3 提取時(shí)間的考察

稱取白芷飲片30 g, 置圓底燒瓶中, 加10 倍水, 分別60 ℃水浴加熱提取0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 3.0h, 提取1 次, 各平行3 份, 按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液, 按“2.1.1” 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定, 分別進(jìn)樣, 記錄色譜圖。 采用外標(biāo)法計(jì)算歐前胡素提取率, 結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 不同提取時(shí)間對(duì)歐前胡素提取率的影響Fig.6 The effect of different extraction times on the extraction rate of imperatorin

2.2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)考察后, 確定三個(gè)影響因素及其因素水平。 因素水平見(jiàn)表1。 在此基礎(chǔ)上, 設(shè)計(jì)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)[7], 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2 所示。 通過(guò)Design-Expert 8.0 軟件建立響應(yīng)面分析模型。

表1 提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)三因素三水平表Table 1 Extraction process response surface test three factors and three levels table

表2 BBD 響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果Table 2 BBD response surface method test results

2.2.5 回歸模型有效性及顯著性分析

將表2 試驗(yàn)條件及結(jié)果導(dǎo)入Design Expert 8.0 軟件進(jìn)行回歸分析。 歐前胡素提取率(Y)對(duì)A、 B、 C 的多項(xiàng)二次回歸模型方程為Y=0.95+0.13A-0.009B+0.005C+0.009AB-0.048AC-0.007BC-0.31A2+0.005B2-0.033C2, 通過(guò)方差分析考察其顯著性, 結(jié)果見(jiàn)表3。 由表3 及表4 可知, 失擬項(xiàng)P=0.5082 ＞0.05, 模型P＜0.0001, r2=0.9913, 表明回歸模型極具顯著性,擬合程度好。 由方差分析P 值可知, A 因素影響極具顯著性;交互項(xiàng)AB、 BC 因素對(duì)綜合得分影響不顯著, AC 因素影響極具顯著性; 二次項(xiàng)A2因素對(duì)綜合得分影響極顯著, C2因素影響具顯著性, B2因素影響不顯著。 由方差分析單因素F 值可看出, B、 C 因素對(duì)綜合得分影響較小, A 因素最大。 綜上所述,各因素的影響順序?yàn)镃＜B＜A。

表3 歐前胡素提取率響應(yīng)面方差分析結(jié)果Table 3 Response surface variance analysis results of imperatorin extraction rate

模型P 值＜0.05 表示顯著, 失擬項(xiàng)P 值＞0.05 表示不顯著,即該模型在被研究的回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好; 多元相關(guān)系數(shù)值R2越大, 說(shuō)明相關(guān)性越好; CV＜10%, 表示試驗(yàn)的可信度和精確度較高; 精密度(Adeq Precision)是有效信號(hào)與噪聲的比值, ＞4視為合理[8]。 從表4 可以看出, 試驗(yàn)的擬合回歸方程符合以上幾個(gè)原則, 適應(yīng)性較好。

表4 歐前胡素提取率回歸方程誤差統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Error statistical analysis of the regression equation of imperatorin extraction rate

2.2.6 等高線圖和3D 響應(yīng)面圖分析

根據(jù)擬合的方程, 采用Design-Expert 8.0 軟件繪制不同變量之間對(duì)歐前胡素提取率影響的等高線圖及3D 效應(yīng)面圖, 如圖7 ～圖9 所示。

圖7 提取溫度與料液比對(duì)歐前胡素提取率的交互影響Fig.7 Interactive influence of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the extraction rate of imperatorin

圖9 提取時(shí)間與料液比對(duì)歐前胡素提取率的交互影響Fig.9 Interactive influence of extraction time and material-to-liquid ratio on the extraction rate of imperatorin

圖8 提取溫度與提取時(shí)間對(duì)歐前胡素提取率的交互影響Fig.8 Interactive influence of extraction temperature and extraction time on the extraction rate of imperatorin

各變量間的相互作用可通過(guò)圓形或橢圓形的等高線圖形狀和三維曲面圖坡度反映, 因素間交互作用顯著, 則等高線的形狀為橢圓形, 交互作用不顯著則為圓形[9], 因素間交互作用強(qiáng)則二維平面圖等高線呈橢圓形且密集, 三維曲面圖陡峭且坡度大, 也可說(shuō)明結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。 圖8 中二維平面圖等高線呈橢圓形且密集, 三維響應(yīng)曲面坡度大, 說(shuō)明A 因素與C 因素之間交互作用強(qiáng), 圖7 和圖9 中二維平面圖等高線雖密集但不近似橢圓形, 說(shuō)明AB 因素與BC 因素之間交互作用弱, 與方差分析結(jié)果相符。

2.2.7 響應(yīng)面模型驗(yàn)證

根據(jù)軟件結(jié)果分析白芷中歐前胡素的最佳提取條件為: 提取溫度71.93 ℃、 液料比8 倍、 提取時(shí)間1.5 h, 在該條件下歐前胡素提取率為0.9752%。 為了實(shí)際操作更方便, 將優(yōu)化后的提取工藝調(diào)整為: 提取溫度72 ℃、 液料比8 倍、 提取時(shí)間1.5 h, 進(jìn)行3 次平行試驗(yàn), 在這些條件下進(jìn)行試驗(yàn)所測(cè)得的白芷歐前胡素提取率為0.97%±0.05%, 實(shí)驗(yàn)值與理論值誤差較小。

3 結(jié) 論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 采用BBD 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化白芷中歐前胡素的提取工藝。 結(jié)果表明, 建立的二元多項(xiàng)式回歸方程擬合的情況較好, 根據(jù)實(shí)際操作對(duì)分析得出的預(yù)測(cè)值進(jìn)行調(diào)整為提取溫度72 ℃、 液料比8 倍、 提取時(shí)間1.5 h,在此條件下白芷中歐前胡素提取率為0.97%±0.005%, 說(shuō)明白芷中歐前胡素提取率可用該模型進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果具有一定的理論價(jià)值與實(shí)際應(yīng)用前景。