進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌血清miR125b、巨噬細(xì)胞抑制因子1表達(dá)變化與抗PD?1/PD?L1單抗治療療效的關(guān)系

韋瓊，姚堅(jiān)，呂學(xué)東

（南通市第一人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇南通226000）

肺癌是全世界最常見的與癌癥相關(guān)的死亡原因，其中非小細(xì)胞肺癌（non?small cell lung cancer，NSCLC）大約占肺癌的85%[1]。大多數(shù)患者在首次診斷時(shí)已處于晚期或已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5 年生存率低于15%，而已存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者僅為4%[2]。近年來，抗程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death receptor?1,PD?1）/程序性細(xì)胞死亡配體1（pro?grammed cell death ligand 1, PD?L1）單抗 治療在NSCLC 治療中已取得顯著療效[3]。但既往多項(xiàng)臨床試驗(yàn)[4?5]結(jié)果顯示，僅有20%的NSCLC 患者能夠獲益。因此，迫切需要尋找預(yù)測抗PD?1/PD?L1單抗治療療效的生物標(biāo)志物。有證據(jù)[6]表明，肺癌細(xì)胞中miR125b 表達(dá)明顯高于正常肺細(xì)胞。一項(xiàng)Meta分析[7]指出，miR125b 高表達(dá)與NSCLC 患者生存率呈負(fù)相關(guān)，miR125b可作為NSCLC預(yù)后評估的生物標(biāo)志物。巨噬細(xì)胞抑制因子1（macrophage inhibitory cytokine?1,MIC?1），是轉(zhuǎn)化生長因子?β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族成員，可參與急性損傷后的炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)，且血清MIC?1 在多種癌癥中表達(dá)水平明顯升高[8]。另外，臨床研究[9]顯示，腫瘤細(xì)胞中MIC?1 過表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。故miR125b、MIC?1 有可能成為NSCLC 治療療效預(yù)測的新的生物標(biāo)志物。既往并未見有關(guān)miR125b、MIC?1 作為NSCLC 抗PD?1/PD?L1 單抗治療療效生物標(biāo)志物的報(bào)道。鑒于此，本研究通過分析進(jìn)展期NSCLC 血清miR125b、MIC?1 表達(dá)變化與抗PD?1/PD?L1 單抗治療療效的關(guān)系，旨在為進(jìn)展期NSCLC治療療效評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇南通市第一人民醫(yī)院2017 年1 月至2019年1 月收治的96 例進(jìn)展期NSCLC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均經(jīng)病理檢查確診為NSCLC；②進(jìn)展期NSCLC（Ⅲb 期和Ⅳ期患者）；③未接受過任何抗腫瘤治療；④美國東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Coopera?tive Oncology Group，ECOG）評分≤2分；⑤預(yù)計(jì)生存時(shí)間＞3 個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并驅(qū)動(dòng)基因陽性患者；②其他惡性腫瘤者；③排除血液系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)疾病者；④無法配合完成隨訪者。96 例進(jìn)展期NSCLC 患者中，男59例，女37例；年齡39～81歲，平均年齡（59.74±8.06）歲；腺癌70 例，鱗癌11 例，大細(xì)胞癌15例；腫瘤分期Ⅲb期36例，Ⅳ期60例；中高分化67 例，低分化29 例；PD?L1 表達(dá)分布：＜1.0%者61 例，1.0%～49.0%者19 例，≥50.0%者16 例。另外，選擇醫(yī)院同期收治的100例肺部良性疾病患者為良性組以及同期于醫(yī)院進(jìn)行體檢的100例健康體檢者為對照組。3 組研究對象年齡、性別方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 治療方法

采用信迪利單抗［信達(dá)生物制藥（蘇州）有限公司，規(guī)格：10 mL：100 mg，國藥準(zhǔn)字S20180016）］靜脈輸注，劑量200 mg，靜脈輸注時(shí)間30～60 min 內(nèi)，每3 周治療1 次；或采用阿特珠單抗（瑞士羅氏公司，規(guī)格1200 mg/20 mL）靜脈輸注，劑量1 200 mg，靜脈輸注時(shí)間60 min 以上，每3 周治療1 次，單用抗PD?1 抗體或抗PD?L1 抗體或聯(lián)合化療。聯(lián)合化療方案：聯(lián)合培美曲塞及鉑類（卡鉑或順鉑）化療。直至患者不可耐受或出現(xiàn)疾病進(jìn)展。另外，Ⅲb 期患者在初始治療或誘導(dǎo)化療后立即介入放療，同期進(jìn)行放化療。

1.3 血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平檢測

抽取對照組體檢時(shí)、良性組治療前和NSCLC組治療前、治療后1、3、6 個(gè)月晨起空腹靜脈血5 mL。采用Real?time PCR 技術(shù)檢測血清miR125b表達(dá)水平，使用TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）血漿中提取總RNA，使用TaqMan miRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國ABI 公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用ABI 7500 儀器進(jìn)行Real?time PCR，以U6 為內(nèi)參，目的基因miR125b 引物為：Forward：5′?CGCGCTCCCT?GAGACCCTAAC?3′ ，Reverse：5′?TGGTGTCGTG?GAGTCG?3′；U6 引物為：Forward：5′?CGCTTCAC?GAATTTGCGTGTCAT?3′ ，Reverse：5′?GCTTCG?GCAGCACATATACTAAAAT?3′。采用ELISA 法檢測血清MIC?1 水平，人MIC?1 ELISA 試劑盒由上海博耀生物科技有限公司提供。

1.4 療效評價(jià)

于治療后1、3、6 個(gè)月采用《腫瘤免疫治療療效評價(jià)的新標(biāo)準(zhǔn)》[10]對NSCLC 患者進(jìn)行治療療效評價(jià)，兩個(gè)連續(xù)觀察點(diǎn)全部病變完全消失且持續(xù)時(shí)間≥4 周（irCR）；兩個(gè)連續(xù)觀察點(diǎn)與基線腫瘤負(fù)荷比較減少50%及以上且持續(xù)時(shí)間≥4 周（irPR）；不符合以上irCR、irPR 標(biāo)準(zhǔn)，未出現(xiàn)irPD（irSD）；與基線腫瘤負(fù)荷比較增加25%及以上（irPD），irCR+ir?PR 表示治療有效，irSD+irPD 表示治療無效。

1.5 隨訪

通過門診方式或電話方式隨訪，末次隨訪時(shí)間為2021 年3 月，每3 個(gè)月進(jìn)行1 次隨訪，隨訪率為100%，最短隨訪時(shí)間為3個(gè)月，最長為26個(gè)月。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以x±s表示，均符合正態(tài)分布，3 組組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用重復(fù)測量方差分析；生存分析采用Kaplan?Meier分析法，生存率比較采用Log?Rank 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前3組患者血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平比較

治療前3 組血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），NSCLC 組血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平明顯高于良性組和對照組（P＜0.05），良性組明顯高于對照組（P＜0.05）。見表1。與對照組比較：*P＜0.05；與良性組比較；#P＜0.05。miR125b：NSCLC 組vs對照組，q=73.713，P＜0.05，NSCLC 組vs良性組，q=55.389，P＜0.05，對照組vs良性組，q=18.514，P＜0.05。MIC?1：NSCLC 組vs對照組，q=79.795，P＜0.05，NSCLC 組vs良性組，q=54.389，P＜0.05，對照組vs 良性組，q=25.669，P＜0.05。

表1 治療前3組患者血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of serum miR125b and MIC?1 levels in three groups before treatment(±s)

表1 治療前3組患者血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平比較Table 1 Comparison of serum miR125b and MIC?1 levels in three groups before treatment(±s)

組別NSCLC組良性組對照組F P n 96 100 100 miR125b 2.68±0.32*#1.35±0.20*0.91±0.17 146 5.238＜0.01 ρ（MIC?1）/（pg·mL-1）1147.51±127.50*#628.06±89.21*385.42±53.73 165 5.034＜0.01

2.2 治療前后NSCLC 患者血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平比較

96 例治療前后NSCLC 患者血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），治療后1、3、6 個(gè)月明顯低于治療前（P＜0.05），且治療后1、3、6個(gè)月呈逐漸下降趨勢（P＜0.05）。見表2。

表2 治療前后NSCLC 患者血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平比較（±s,n=96）Table 2 Comparison of levels of serum miR125b and MIC?1 in patients with NSCLC before and after treatment

表2 治療前后NSCLC 患者血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平比較（±s,n=96）Table 2 Comparison of levels of serum miR125b and MIC?1 in patients with NSCLC before and after treatment

時(shí)間治療前治療后1個(gè)月治療后3個(gè)月治療后6個(gè)月F P miR125b 2.68±0.32 2.22±0.25 2.09±0.21 1.76±0.17 234.519＜0.01 ρ（MIC?1）/（pg·mL-1）114 7.51±127.50 102 9.36±112.83 951.42±103.64 886.73±92.49 100.091＜0.01

2.3 血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平與NSCLC 患者病理分期、分化程度有關(guān)（P＜0.01），與年齡、性別以及病理類型無關(guān)（P＞0.05）。見表3。

2.4 抗PD?1/PD?L1單抗治療進(jìn)展期NSCLC患者的臨床療效

96 例進(jìn)展期NSCLC 患者進(jìn)行抗PD?1/PD?L1單抗治療6 個(gè)月后，irCR 0 例，irPR 16 例（16.67%），irSD 38 例（39.58%），irPD 42 例（43.75%），即有效組16例，無效組80例。

2.5 治療前血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平與抗PD?1/PD?L1單抗治療療效的關(guān)系

有效組治療前血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平明顯低于無效組（P＜0.01）。見表4。

2.6 血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC患者總生存期的關(guān)系

Kaplan?Meier 生存分析顯示，血清miR125b 高表達(dá)組和MIC?1 高表達(dá)組患者平均生存時(shí)間和生存率均明顯低于miR125b低表達(dá)組和MIC?1低表達(dá)組患者（P＜0.01）。見表5和圖1、圖2。

2.7 影響抗PD?1/PD?L1單抗治療進(jìn)展期NSCLC患者生存時(shí)間的多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期、分化程度、治療療效、miR125b 表達(dá)水平、MIC?1 表達(dá)水平與抗PD?1/PD?L1 單抗治療進(jìn)展期NSCLC 患者生存時(shí)間有關(guān)。多因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，腫瘤分期（Ⅳ期）、分化程度（低分化）、治療療效（irSD 和irPD）、miR125b 表達(dá)水平（高表達(dá)）、MIC?1 表達(dá)水平（高表達(dá)）是影響抗PD?1/PD?L1 單抗治療進(jìn)展期NSCLC患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表6。

3 討論

抗PD?1/PD?L1 單抗治療晚期肺癌患者的療效及安全性良好，且患者能夠獲得長期緩解，基于抗PD?1/PD?L1 單抗的腫瘤免疫治療給進(jìn)展期NSCLC患者帶來了新的曙光[11]。但僅有20%的患者可獲得長期療效，大多數(shù)患者可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)[12]。故尋找有效的生物標(biāo)志物以及開發(fā)新的靶點(diǎn)是目前提高進(jìn)展期NSCLC患者免疫治療響應(yīng)率的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

研究[13]表明，miRNAs 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，多種miRNAs 被認(rèn)為是腫瘤診斷和預(yù)后以及治療反應(yīng)監(jiān)測的有效生物標(biāo)志物。報(bào)道證實(shí)，miR125b在多種腫瘤中異常表達(dá)，包括在乳腺癌[14]、肝細(xì)胞癌[15]中下調(diào)表達(dá)，在胃癌[16]、腎細(xì)胞癌[17]中上調(diào)表達(dá)。Wang 等[18]報(bào)道表明，肺癌組織中miR125b 表達(dá)高于癌旁正常組織，miR125b 可能在肺癌中發(fā)揮著癌基因作用。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組血清miR125b 表達(dá)水平高于良性組和對照組，表明miR125b 在進(jìn)展期NSCLC 中異常表達(dá)。同時(shí)，本研究中，與治療前相比，治療后1、3、6 個(gè)月NSCLC患者血清miR125b表達(dá)水平均明顯降低，且呈逐漸下降趨勢，提示miR125b 有望作為進(jìn)展期NSCLC 患者治療療效的評價(jià)指標(biāo)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平與NSCLC 患者病理分期、分化程度以及治療療效密切相關(guān)，且miR125b高表達(dá)組患者生存率低于miR125b低表達(dá)組，表明miR125b 可能作為進(jìn)展期NSCLC 患者抗PD?1/PD?L1 單抗治療療效和預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)。Yagi 等報(bào)道[19]表明，大腸癌患者miR125b 表達(dá)水平高于健康對照組，miR125b 高表達(dá)組患者無進(jìn)展生存率低于miR125b 低表達(dá)組，且miR125b 表達(dá)水平是影響患者無進(jìn)展生存率的獨(dú)立因素，血漿miR125b 表達(dá)水平可能有助于早期檢測mFOLF?OX6 一線化療治療晚期和復(fù)發(fā)性大腸癌的耐藥性。本研究中，miR125b 表達(dá)水平與抗PD?1/PD?L1 單抗治療療效有關(guān)，miR125b低表達(dá)水平提示治療有效。另一項(xiàng)研究[20]認(rèn)為，miR?125b 通過下調(diào)EVA1A 介導(dǎo)的自噬作用和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而降低肝癌細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性。因此，miR125b 不僅是評估治療療效的指標(biāo)，也可能作為靶向治療的靶點(diǎn)。

表3 血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relationship between the levels of serum miR125b and MIC?1 and clinicopathological characteristics of patients with advanced NSCLC(±s)

表3 血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relationship between the levels of serum miR125b and MIC?1 and clinicopathological characteristics of patients with advanced NSCLC(±s)

臨床病理特征年齡/a＜60≥60性別男 女病理類型腺癌鱗癌大細(xì)胞癌腫瘤分期Ⅲb期Ⅳ期分化程度高中分化低分化例數(shù)38 58 59 37 70 11 15 36 60 67 29 miR125b 2.72±0.33 2.65±0.30 2.66±0.29 2.71±0.35 2.64±0.28 2.75±0.31 2.82±0.37 2.13±0.20 3.01±0.36 2.36±0.24 3.42±0.39 F/t 1.074 0.759 2.580 13.456 16.285 P 0.285 0.450 0.081＜0.01＜0.01 ρ（MIC?1）/（pg·mL-1）1 169.11±128.56 1 133.36±125.04 1 154.38±130.15 1 136.56±126.52 1 158.04±126.33 1 151.95±127.84 1 095.11±110.09 902.41±95.08 1 294.57±134.75 1 055.39±101.42 1 360.34±137.06 F/t 1.355 1.111 1.594 15.310 12.118 P 0.179 0.267 0.209＜0.01＜0.01

表4 治療前血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平與抗PD?1/PD?L1單抗治療療效的關(guān)系Table 4 Relationship between the levels of serum miR125b and MIC?1 before treatment and the therapeutic effect of anti?PD?1/PD?L1 monoclonal antibody(±s)

表4 治療前血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平與抗PD?1/PD?L1單抗治療療效的關(guān)系Table 4 Relationship between the levels of serum miR125b and MIC?1 before treatment and the therapeutic effect of anti?PD?1/PD?L1 monoclonal antibody(±s)

組別有效組無效組t P例數(shù)16 80 miR125b 2.05±0.27 2.81±0.42 6.940＜0.01 ρ（MIC?1）/（pg·mL-1）893.47±102.03 119 8.32±136.49 8.459＜0.01

既往研究[21?22]表明，MIC?1可作為部分腫瘤的診斷指標(biāo)。Xu[23]等報(bào)道表明，MIC?1對NSCLC有一定的診斷價(jià)值，此外，MIC?1 水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和病理分期密切相關(guān)，且MIC?1 陽性患者無進(jìn)展生存率和總生存率低于MIC?1 陰性患者，血清MIC?1 可作為NSCLC 診斷和預(yù)后的有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，NSCLC 組血清MIC?1表達(dá)水平高于良性組和對照組，且其表達(dá)水平在治療后明顯低于治療前。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，血清MIC?1表達(dá)水平與NSCLC患者病理分期、分化程度以及治療療效密切相關(guān)，提示MIC?1 可能是預(yù)測NSCLC患者腫瘤進(jìn)展的指標(biāo)之一，還可能用于評估患者治療療效。這與孔蕾等[24]報(bào)道一致。本研究中，進(jìn)一步Kaplan?Meier 生存分析顯示，MIC?1 高表達(dá)組患者生存率低于miR125b 低表達(dá)組，提示檢測血清MIC?1表達(dá)水平有助于預(yù)測NSCLC患者預(yù)后。

表5 血清miR125b、MIC?1表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC患者總生存期的關(guān)系Table 5 Relationship between the levels of serum miR125b and MIC?1 and overall survival time of patients with advanced NSCLC

圖1 血清miR125b 表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC 患者生存時(shí)間的關(guān)系Figure 1 Relationship between serum miR125b level and survival time of patients with advanced NSCLC

圖2 血清MIC?1 表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC 患者生存時(shí)間的關(guān)系Figure 2 Relationship between serum MIC?1 level and survival time of patients with advanced NSCLC

表6 影響抗PD?1/PD?L1單抗治療進(jìn)展期NSCLC患者生存時(shí)間的多因素COX回歸分析Table 6 Multivariate Cox regression analysis of survival time of patients with advanced NSCLC treated with anti?PD?1/PD?L1 monoclonal antibody

多因素COX 回歸分析結(jié)果顯示，miR125b、MIC?1 表達(dá)水平是影響抗PD?1/PD?L1 單抗治療進(jìn)展期NSCLC 患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。此外，腫瘤分期、分化程度、治療療效也是影響NSCLC患者預(yù)后的因素。但miR125b和MIC?1影響抗PD?1/PD?L1 單抗治療療效的機(jī)制尚未闡明。目前證據(jù)[25]表明，miR125b 能夠影響細(xì)胞增殖和凋亡，miR125b上調(diào)表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用，從而增加對順鉑的耐藥性。TGF-β2可能通過介導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換和NF?κB 通路激活，從而促進(jìn)奧希替尼耐藥[26]。但本研究仍存在一些局限性，僅納入進(jìn)展期NSCLC 患者，且未開展體外實(shí)驗(yàn)研究以進(jìn)一步探討miR125b、MIC?1 影響進(jìn)展期NSCLC 患者抗PD?1/PD?L1單抗治療療效的分子機(jī)制，故后續(xù)有待進(jìn)一步開展體內(nèi)和體外功能和臨床研究，以提供更多理論支持。

綜上所述，血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平與進(jìn)展期NSCLC 患者病理分期、分化程度以及抗PD?1/PD?L1 單抗治療療效有關(guān)，miR125b、MIC?1 低表達(dá)患者生存率明顯降低，檢測血清miR125b、MIC?1 表達(dá)水平有助于預(yù)測患者預(yù)后。