尤瑞克林通過(guò)提高ALDH2 表達(dá)改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷

王少津，許麗娃，吳和弟

（1.?？谑腥嗣襻t(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南?？?70000；2.海口市人民醫(yī)院老年病科，海南?？?70000）

2 型糖尿病是指因機(jī)體胰島素分泌不足或是胰島素抵抗所致機(jī)體的血糖水平呈持續(xù)性異常升高的慢性疾病，全球2 型糖尿病病例數(shù)在1994 年約1.20 億、1999 年約1.35 億、2000 年約1.75 億、2010 年約2.39 億，預(yù)計(jì)2025 年可能會(huì)突破3 億，其發(fā)病趨勢(shì)在近幾十年呈現(xiàn)出難以緩解的趨勢(shì)[1]。過(guò)去的幾十年中2 型糖尿病在老年群體中的發(fā)病率較高，但如今在青壯年群體中的發(fā)病率呈現(xiàn)出顯著升高趨勢(shì)，甚至在兒童或青少年中也可發(fā)生，有的國(guó)家小兒2 型糖尿病占糖尿病患者的一半以上[2]。在全球糖尿病惡化趨勢(shì)的大環(huán)境下，我國(guó)每年新增糖尿病患者120萬(wàn)人，其發(fā)病率僅次于印度，由于我國(guó)的人口基數(shù)大且老齡化加劇，我國(guó)糖尿病病例數(shù)有可能超過(guò)印度[3]。2型糖尿病患者若血糖水平控制不佳，可引起心、腦、腎等重要器官組織損傷，產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，尤其是腦卒中[4]。尤瑞克林是一種用于治療急性腦缺血的血管藥物，具有選擇性地?cái)U(kuò)張腦缺血組織部位的腦血管的作用，還可以減輕腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的損傷和促進(jìn)腦內(nèi)源性的神經(jīng)再生，但其中的干預(yù)機(jī)制尚不清楚[5]。乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是乙醛脫氫酶的同工酶，是催化多種醛類物質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，也參與腦梗死調(diào)節(jié)過(guò)程[6]。尤瑞克林對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用是否與ALDH2 有關(guān)尚不清楚。因此，本研究主要是基于ALDH2 探討尤瑞克林對(duì)糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠，6～7 周齡，體質(zhì)量（240±10）g，購(gòu)于廣州賽業(yè)百沐生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2020?0055，于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

ALDH2 阻斷劑氨基氰（cyanamide，Cya）（美國(guó)Sigma 公司）；尤瑞克林（廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）、過(guò)氧化氫酶（catalase、CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細(xì)胞介素?6（interleukin?6，IL?6）、白細(xì)胞介素?1β（inter?leukin?1β，IL?1β）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；TUNEL 試劑盒（德國(guó)Roche 公司）；兔多抗B淋巴細(xì)胞瘤?2（Bcl?2）、Bcl?2相關(guān)x蛋白（Bax）、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶?3（Cleaved?caspase?3）、ALDH2、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（英國(guó)Ab?cam 公司）。腦立體定位儀（美國(guó)STOELTING 公司）；普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；Light?cyce480實(shí)時(shí)定量PCR儀（羅氏診斷公司）。

1.3 糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠模型制備和分組

60 只SPF 級(jí)SD 大鼠，使用體質(zhì)量編號(hào)和隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組、模型組、尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組，每組15 只。使用無(wú)菌STZ 聯(lián)合Zea?Longa法制備糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠模型[7]，糖尿病造模前禁食、禁水8 h，腹腔注射STZ，注射劑量為2 mg/100 g，1周后使用血糖儀檢測(cè)大鼠外周血血糖濃度，若連續(xù)7 d測(cè)得空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L表示2型糖尿病模型制備成功，此次制模全部成功。對(duì)照組給予等體積的緩沖液。隨后將大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，固定在腦立體定位儀，常規(guī)消毒、暴露顱骨，前囟點(diǎn)作為定點(diǎn)并標(biāo)記，尤瑞克林+Cya 組使用微量注射器將1 mg/5 μL阻斷劑Cya注入給藥，模型組、尤瑞克林組注射等體積的助溶劑DMSO，對(duì)照組不做任何注射。完成后24 h，使用Zea?Longa法將糖尿病大鼠制成腦缺血再灌注大鼠模型，阻斷2 h再恢復(fù)血供，若大鼠出現(xiàn)身體不自主旋轉(zhuǎn)視為模型制備成功，此次制模全部成功。對(duì)照組除不進(jìn)行尼龍線插入，其余操作其他各組大鼠一樣。在恢復(fù)血供30 min時(shí)，尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya組舌下靜脈給藥尤瑞克林8.75×10?3PNA 單位/kg，對(duì)照組、模型組舌下靜脈注射同體積的生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能評(píng)分各組大鼠缺血再灌注24 h，Longa 法[8]進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)估：無(wú)異常表現(xiàn)（0 分，無(wú)神經(jīng)損傷），左側(cè)前肢不完全伸展（1 分，輕度神經(jīng)功能缺損），爬行過(guò)程中向左轉(zhuǎn)圈（2 分，中度神經(jīng)功能缺損），爬行過(guò)程中傾倒、翻轉(zhuǎn)（3 分，重度神經(jīng)功能缺損），意識(shí)不清、無(wú)法行走（4 分），死亡（5分）。

1.4.2 腦含水量神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)估后，斷頭處死大鼠，迅速分離腦組織，沿矢狀縫切開(kāi)，左腦稱質(zhì)量（計(jì)為濕質(zhì)量），100 ℃恒溫烘箱中烤72 h 并再次稱質(zhì)量（計(jì)為干質(zhì)量），計(jì)算腦含水量=（腦組織濕質(zhì)量-腦組織干質(zhì)量）/腦組織濕質(zhì)量×100%。

1.4.3 HE 染色將大鼠腦組織置于4%（φ）多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、10 μm 切片、二甲苯脫蠟、復(fù)水、蘇木素和伊紅染色、脫水、透明、固定封片，顯微鏡鏡檢。

1.4.4 TUNEL 染色取“1.3.4”中的石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化，嚴(yán)格按照TUNEL 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)，封片后，隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊視野，用Image J 軟件分析細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.5 SOD、CAT、MDA、TNF?α、IL?6、IL?1β水平檢測(cè)將腦組織制成組織勻漿，酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)SOD、CAT、MDA、TNF?α、IL?6、IL?1β水平。

1.4.6 Western blot 檢測(cè)蛋白水平提取腦組織總蛋白，Bradford 調(diào)整各組蛋白濃度一致，經(jīng)SDS?PAGE凝膠電泳（濃縮膠100 V電泳1.5 h、12%分離膠70 V電泳至距離膠邊緣5 mm 停止電泳），電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜（200 mA 電流轉(zhuǎn)移2 h），5%脫脂奶粉室溫密封2 h，加入Cleaved?caspase?3（1∶1 000）、Bcl?2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、ALDH2（1∶1 000）、GAP?DH（1∶100）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗40 min，加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，顯色、定影、采集影像，Image J 軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行作圖，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用±s表示，多組間數(shù)據(jù)分析使用單因素方法分析，后兩兩比較使用SNK 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量比較

模型組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量均高于對(duì)照組（P＜0.05），尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量均低于模型組（P＜0.05），尤瑞克林+Cya 組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量均高于尤瑞克林組（P＜0.05），見(jiàn)表1、2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較Table 1 Comparison on scores of nerve function in each group

表2 各組大鼠腦含水量比較Table 2 Comparison on brain water content in each group

2.2 各組大鼠腦組織病理情況

對(duì)照組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)正常、細(xì)胞排列和組織染色均勻。模型組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)異常、細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)細(xì)胞空泡化和核固縮、裂解嚴(yán)重。尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常和排列紊亂現(xiàn)象較模型組得到明顯改善，見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠腦組織凋亡情況

模型組大鼠的細(xì)胞凋亡率、Cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05），而B(niǎo)cl?2/Bax、ALDH2蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組（P＜0.05）；尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的細(xì)胞凋亡率、Cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)均低于模型組（P＜0.05），而B(niǎo)cl?2/Bax、ALDH2蛋白表達(dá)均高于模型組（P＜0.05）；尤瑞克林+Cya 組大鼠的細(xì)胞凋亡率、Cleaved?caspase?3蛋白表達(dá)均高于尤瑞克林組（P＜0.05），而B(niǎo)cl?2/Bax、ALDH2蛋白表達(dá)均低于尤瑞克林組（P＜0.05），見(jiàn)圖2、表3。

2.4 各組腦組織SOD、CAT、MDA水平比較

模型組大鼠的MDA 水平高于對(duì)照組（P＜0.05），而SOD、CAT活性均低于對(duì)照組（P＜0.05）；尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的MDA 水平低于模型組（P＜0.05），而SOD、CAT 活性均高于模型組（P＜0.05）；尤瑞克林+Cya 組大鼠的MDA 水平高于尤瑞克林組（P＜0.05），而B(niǎo)cl?2/Bax、ALDH2 蛋白表達(dá)均低于尤瑞克林組（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.5 各組腦組織TNF?α、IL?6、IL?1β含量比較

模型組大鼠的TNF?α、IL?6、IL?1β水平高于對(duì)照組（P＜0.05），尤瑞克林組、尤瑞克林+Cya 組大鼠的TNF?α、IL?6、IL?1β水平低于模型組（P＜0.05），尤瑞克林+Cya 組大鼠的TNF-α、IL?6、IL?1β水平高于尤瑞克林組（P＜0.05），見(jiàn)表5。

3 討論

糖尿病是短暫性腦缺血發(fā)作早期卒中和晚期復(fù)發(fā)卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高血糖可以引起內(nèi)膜損傷、乳酸累積、破壞血腦屏障、促進(jìn)興奮性氨基酸聚集，一旦出現(xiàn)腦缺血、缺氧時(shí)，機(jī)體組織中無(wú)氧酵解增多，酸性物質(zhì)堆積增多，從而使細(xì)胞內(nèi)外的酸中毒加重，進(jìn)一步加劇患者的腦組織中能量代謝過(guò)程[9]。因此，急性腦缺血患者發(fā)病期間必須了解患者血糖情況，控制血糖升高程度。糖尿病所致的動(dòng)脈粥樣硬化先是損傷動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞，若還存在代謝障礙、內(nèi)分泌紊亂或免疫功能障礙會(huì)進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷[10]。糖尿病患者機(jī)體的血小板的聚集性增強(qiáng)，內(nèi)皮細(xì)胞損傷處容易聚集血小板和形成血小板、白色的血栓，產(chǎn)生釋放反應(yīng)，同時(shí)釋放能夠促進(jìn)血小板聚集、動(dòng)脈收縮等物質(zhì)，加重腦血管疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究通過(guò)構(gòu)建糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠模型顯示模型組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量均較健康大鼠呈出明顯升高趨勢(shì)，腦含水量增加表明腦組織存在組織損傷，本研究結(jié)果表明糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠確實(shí)存在神經(jīng)功能損傷。

尤瑞克林為人尿激肽原酶，對(duì)激肽有裂解作用，從而產(chǎn)生激肽，目前常用于急性進(jìn)展性腦梗死臨床治療，表現(xiàn)出良好的治療效果[12]。ALDH2基因是位于人12號(hào)染色體上，其編碼的蛋白屬于核基因編碼蛋白，具有酯酶、脫氫酶和還原酶的活性，通過(guò)多肽入線粒體中發(fā)揮作用，可在心、肝、腦等重要器官組織中表達(dá)[13]。本研究結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織中的ALDH2 蛋白表達(dá)較健康大鼠呈現(xiàn)出明顯降低趨勢(shì)，經(jīng)尤瑞克林干預(yù)大鼠腦組織中的ALDH2蛋白表達(dá)較模型組大鼠呈現(xiàn)出明顯升高趨勢(shì)，而在尤瑞克林干預(yù)增加ALDH2 阻斷劑Cya 大鼠的腦組織中的ALDH2 蛋白表達(dá)較尤瑞克林干預(yù)組降低，推測(cè)尤瑞克林可提高ALDH2 蛋白表達(dá)。通過(guò)大鼠腦組織病理HE 染色觀察發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、分布紊亂，尤瑞克林干預(yù)可以明顯改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠腦組織病理情況，增加ALDH2阻斷劑Cya干預(yù)可部分逆轉(zhuǎn)尤瑞克林的改善效果，再次說(shuō)明尤瑞克林可以改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠腦組織損傷，可能與ALDH2有關(guān)。

圖1 大鼠腦組織HE染色Figure 1 HE staining of brain tissues in rats(200×,n=5)

圖2 各組大鼠海馬組織中細(xì)胞蛋白及ALDH2表達(dá)Figure 2 Expressions of cellular proteins and ALDH2 in hippocampus of each group

腦缺血再灌注損傷會(huì)引起腦神經(jīng)功能損傷，此過(guò)程受到多種生理過(guò)程調(diào)節(jié)，本研究結(jié)果顯示模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率、Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)升高，而B(niǎo)cl?2/Bax 比值降低，尤瑞克林干預(yù)降低糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠腦組織凋亡率、Cleaved caspase?3 蛋白表達(dá)和提高Bcl?2/Bax 比值，而ALDH2 阻斷劑Cya 干預(yù)可部分逆轉(zhuǎn)尤瑞克林的調(diào)節(jié)趨勢(shì)。Bcl?2、Bax均為Bcl?2家族中參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的重要蛋白，其比值與線粒體的功能有關(guān)，同時(shí)其在線粒體結(jié)構(gòu)完整性方面表現(xiàn)出拮抗作用，在細(xì)胞凋亡過(guò)程分別發(fā)揮抑制、促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用[14]。caspase?3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡多種途徑的最終執(zhí)行者，其在正常生理狀態(tài)下是以非生物活性形式存在，當(dāng)接受到細(xì)胞凋亡信號(hào)刺激時(shí)，caspase 家族成員通過(guò)剪切作用轉(zhuǎn)化為生物活性的狀態(tài)，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[15]。由此說(shuō)明，尤瑞克林對(duì)糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷的改善作用可能與調(diào)節(jié)ALDH2水平有關(guān)。

腦缺氧缺血時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基并誘導(dǎo)機(jī)體的氧化應(yīng)激增強(qiáng)，適當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激可以提

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 3 Comparison on apoptosis rates and relative expression levels of apoptosis proteins in brain tissues of each group(±s,n=15)

表3 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較Table 3 Comparison on apoptosis rates and relative expression levels of apoptosis proteins in brain tissues of each group(±s,n=15)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尤瑞克林組比較：&P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組尤瑞克林組細(xì)胞凋亡率/%8.36±1.41 44.26±3.24*20.41±3.68#Bcl?2/Bax 2.58±0.08 0.16±0.04 1.44±0.07#Cleaved?caspase?3 0.23±0.08 0.94±0.08*0.46±0.05#ALDH2 0.84±0.05 0.20±0.06*0.69±0.04#尤瑞克林+Cya組31.85±2.74�.68±0.04�.78±0.05�.49±0.05&#

表4 各組腦組織SOD、CAT、MDA水平比較Table 4 Comparison of SOD，CAT and MDA levels in brain tissues of each group(±s,n=15)

表4 各組腦組織SOD、CAT、MDA水平比較Table 4 Comparison of SOD，CAT and MDA levels in brain tissues of each group(±s,n=15)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尤瑞克林組比較：&P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組尤瑞克林組尤瑞克林+Cya組SOD/（U·L-1）16.39±1.74 3.98±1.05*13.69±1.87#7.98±1.85&#MDA/（mmol·mL-1）14.99±1.69 49.62±2.84*26.98±2.87#37.11±3.22&#CAT/（U·L-1）21.94±2.99 8.96±1.42*17.58±2.34#12.67±2.41&#

表5各組腦組織TNF?α、IL?6、IL?1β含量比較

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05；與尤瑞克林組比較：&P＜0.05。

Table 5Comparison on the levels of TNF?α，IL?6 and IL?1βin brain tissues of each group(±s,n=15)高機(jī)體自身抵抗力，但是過(guò)度的氧化應(yīng)激會(huì)超出機(jī)體自身SOD、CAT 清除氧自由基能力，過(guò)量的氧化應(yīng)激反應(yīng)會(huì)發(fā)生細(xì)胞膜攻擊和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性損傷，并給機(jī)體造成損傷，而MDA 就是此損傷過(guò)程中的代謝產(chǎn)物之一[16]。糖尿病患者自身血糖一直處于較高水平，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，腦組織缺氧缺血會(huì)加重這種應(yīng)激狀態(tài)，高血糖還會(huì)加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可促進(jìn)血小板等物質(zhì)在損傷處聚集，加重腦缺血缺氧性損傷。本研究結(jié)果顯示尤瑞克林可以降低糖尿病合并腦缺缺血再灌注大鼠腦組織MDA、TNF?α、IL?6、IL?1β水平和提高SOD、CAT 活性，而Cya 可以部分逆轉(zhuǎn)這種趨勢(shì)。已有研究[17]表明抑制ALDH2 表達(dá)可以明顯提高脂多糖誘導(dǎo)下的心肌細(xì)胞的IL?6 和TNF?α水平升高，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。還有學(xué)者[18]研究顯示ALDH2 可在氯胺酮所致的膀胱炎中發(fā)揮抗炎、抗纖維化的作用，Tsai 等[19]發(fā)現(xiàn)ALDH2 可以通過(guò)減少活性氧、血管炎癥和血管平滑肌細(xì)胞凋亡來(lái)預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生。本研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，說(shuō)明尤瑞克林對(duì)糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的改善作用可能與提高ALDH2表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，尤瑞克林可改善糖尿病合并腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，其發(fā)揮這些作用可能與提高ALDH2 表達(dá)有關(guān)，但其中的詳細(xì)機(jī)制還需要在分子生物學(xué)層面開(kāi)展探討。