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    當(dāng)歸六黃湯UPLC指紋圖譜的建立及4種成分的含量測定

    2022-04-26 07:53:32曾杉史紫娟陳偉彥高永堅梁鳳友
    廣東藥科大學(xué)學(xué)報 2022年2期
    關(guān)鍵詞:黃湯小檗黃柏

    曾杉,史紫娟,陳偉彥,高永堅,梁鳳友

    (國藥集團廣東環(huán)球制藥有限公司,廣東佛山528305)

    當(dāng)歸六黃湯源自金代李東垣編纂的《蘭室秘藏》,被后世廣泛認(rèn)作“治盜汗”的良藥,由當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏、黃芪七味藥組成[1?3]。眾醫(yī)家根據(jù)中醫(yī)理論對當(dāng)歸六黃湯進行組方配伍解析:當(dāng)歸味甘、辛,性溫,具有養(yǎng)血作用,生地味甘苦涼,熟地味甘微溫,具有滋陰作用,三藥合用,共奏滋陰制火之功,共為君藥;黃芩、黃連和黃柏味苦性寒,分別具瀉上、中、下焦火的作用,三藥合用,清熱瀉火作用更強,共為臣藥;黃芪為佐藥,味甘性溫,可發(fā)揮益氣固表的作用。全方七味藥合用,主治陰虛火旺所致的盜汗[4?6]。

    當(dāng)歸六黃湯作為《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中收錄的方劑之一,臨床應(yīng)用經(jīng)驗豐富。然而該方藥味數(shù)量多、化學(xué)成分種類復(fù)雜且含量差異較大,目前針對當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基礎(chǔ)和指紋圖譜研究的文獻甚少[7?8]。指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測定是中藥復(fù)方制劑一種常用的質(zhì)控手段,兩者結(jié)合能夠反映經(jīng)典名方的整體基礎(chǔ)物質(zhì)情況。本研究利用構(gòu)建的當(dāng)歸六黃湯UPLC 指紋圖譜方法,同時測定了處方中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4 種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),以期為經(jīng)典名方當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)及制劑的開發(fā)生產(chǎn)提供依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    H?class 型高效液相色譜儀(Waters UPLC);MS105 型電子天平(梅特勒?托利多公司;2002E 型電子天平(梅特勒?托利多公司);KQ?500DE 型數(shù)控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司);MILLI?PORE Synergy 超純水儀(美國默克公司);HN101?3A型電熱鼓風(fēng)干燥烘箱(南通滬南科學(xué)儀器有限公司);Synergy UV型超純水儀(美國默克公司)。

    1.2 試藥

    黃芩苷(批號:110715?201720)、鹽酸小檗堿(批號:10713?201813)、鹽酸黃柏堿(批號:111895?201504)、阿魏酸(批號:110773?201614)、漢黃芩苷(批號:1112002?201702)對照品由中國食品藥品檢定研究院提供;木蘭花堿(批號:180226?004)、千層紙素A 苷(批號:18040202)、表小檗堿(批號:19012103)對照品由中山市成諾生物科技有限公司提供;甲醇、乙腈為HPLC級。

    1.3 樣品

    當(dāng)歸、地黃、熟地黃、黃芩、黃柏、黃連、黃芪均購自主產(chǎn)區(qū)或道地產(chǎn)區(qū),由廣東一方制藥有限公司鑒定分別為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根、玄參科植物地黃Rehmannia glutino?sa Libosch.的新鮮或干燥塊根、唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根、蕓香科植物黃皮Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮、毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖、豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus Hsiao的干燥根。

    當(dāng)歸六黃湯共15 個批次,編號為S1-S15,方中7味藥的產(chǎn)地信息見表1。

    表1 15批樣品產(chǎn)地信息Table 1 Origin information of 15 batches of samples

    2 方法與結(jié)果

    2.1 當(dāng)歸六黃湯樣品的制備

    當(dāng)歸六黃湯在《蘭室秘藏》原文中制法記載為“當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏各等分,黃芪加一倍,共為粗末,每服五錢,水二盞煎至一盞?!辈殚單墨I資料,確定金元時期一錢為現(xiàn)今3.73 g,一盞為現(xiàn)今150 mL。依照古方,即稱取當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏飲片各2.33 g,黃芪飲片4.66 g,置于1 L電陶瓷煎藥壺中,加水300 mL,煎煮至150 mL,煎液分裝后進行低溫冷凍干燥,得復(fù)方凍干粉。

    2.2 指紋圖譜的建立

    2.2.1 色譜條件色譜柱:Waters CORTECST3(150mm×2.1 mm,1.6 μm);流動相:0.1%磷酸溶液(A)?乙腈(B),梯度洗脫(0~15 min,5%→20%B;15~30 min,20%→25%B;30~45 min,25%→95%B);柱溫為25 ℃;流速為0.25 mL/min;進樣量為1 μL;檢測波長為285 nm。

    2.2.2 對照品溶液的制備取黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸、木蘭花堿、千層紙素A 苷、表小檗堿、漢黃芩苷對照品適量,精密稱定,分別加70%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇制成每1 mL 各含黃芩苷189.5 μg、鹽酸小檗堿186.2 μg、鹽酸黃柏堿49.7 μg、阿魏酸25.1 μg、木蘭花堿87.5 μg、千層紙素A 苷86.3 μg、表小檗堿85.4 μg、漢黃芩苷83.2 μg 的對照品溶液。

    2.2.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸六黃湯凍干粉約0.1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理20 min,放冷,用70%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

    2.2.4 精密度試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液(S5),按“2.2.1”項色譜條件進樣6次,導(dǎo)出色譜圖并計算相似度均大于0.95,表明儀器精密度良好。

    2.2.5 穩(wěn)定性試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液(S5),按“2.2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定,導(dǎo)出色譜圖并計算相似度均大于0.95,結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.2.6 重復(fù)性試驗取同一批當(dāng)歸六黃湯樣品(S5),平行制備6份供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進樣測定,導(dǎo)出6 份色譜圖并計算相似度均大于0.95,表明方法重復(fù)性良好。

    2.2.7 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定制備15批當(dāng)歸六黃湯供試品溶液,按指紋圖譜方法進行檢測,將色譜結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012 版”進行分析,標(biāo)定20 個特征峰并生成對照指紋圖譜,見圖1-2。與對照品進行對照,確證了8 個色譜峰,分別為3 號峰鹽酸黃柏堿,5 號峰綠原酸,6號峰木蘭花堿,8號峰阿魏酸,11號峰表小檗堿,12號峰黃芩苷,14號峰鹽酸小檗堿,17號峰千層紙素A苷,18號峰漢黃芩苷。對15批次當(dāng)歸六黃湯指紋圖譜與對照圖譜之間進行相似度比較,見表2??梢?,15 批當(dāng)歸六黃湯樣品相似度結(jié)果均大于0.90,表明不同產(chǎn)地各藥味成分穩(wěn)定,無較大差異。

    圖1 15批當(dāng)歸六黃湯UPLC指紋圖譜疊加圖Figure 1 UPLC fingerprints of 15 batches of Danggui Liuhuang decoction

    圖2 當(dāng)歸六黃湯UPLC對照指紋圖譜Figure 2 HPLC reference fingerprint of Danggui Liuhuang decoction

    表2 15批當(dāng)歸六黃湯樣品相似度評價結(jié)果Table 2 Fingerprint similarities of 15 batches of Danggui Liuhuang decoction

    2.3 當(dāng)歸六黃湯中4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

    2.3.1 色譜條件同“2.2.1”項色譜條件。

    2.3.2 對照品溶液的制備取黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸對照品適量,精密稱定,分別加70%甲醇制成每1 mL 各含黃芩苷189.5 μg、鹽酸小檗堿186.2 μg、鹽酸黃柏堿49.7 μg、阿魏酸25.1 μg的對照品溶液。

    2.3.3 供試品溶液的制備取當(dāng)歸六黃湯凍干粉碾細,精密稱定0.1 g,置具塞錐形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,用70%甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

    2.3.4 專屬性試驗取當(dāng)歸六黃湯供試品溶液(S5)、對照品溶液、空白溶劑按“2.2.1”項下方法進樣測定,結(jié)果表明黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4個成分的色譜峰專屬性好,理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計算應(yīng)不低于10 000,見圖3。

    2.3.5 線性關(guān)系考察分別各取“2.3.2”項中4 個成分對照品溶液適量,逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為100%、75%、50%、25%、10%、1%的對照品溶液,按指紋圖譜色譜條件測定,記錄峰面積?質(zhì)量濃度的線性回歸方程為:黃芩苷,Y=19 063X+6 744.9(R=0.999 9);鹽酸黃柏堿,Y=5 622.8X-97.04(R=0.999 9);鹽酸小檗堿,Y=20 807X-7 813.3(R=0.999 9);阿魏酸,Y=12 473X-673.4(R=0.999 9),結(jié)果表明黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸分別在1.895~189.5、1.862~186.2、0.497~49.7、0.251~25.1 μg/mL 的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.3.6 精密度試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液(S5),按“2.2.1”項色譜條件進樣6 次,計算黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸峰面積的RSD值分別為1.1%、1.2%、1.1%和1.5%,表明儀器精密度良好。

    2.3.7 穩(wěn)定性試驗取同一份當(dāng)歸六黃湯供試品溶液(S5),按“2.2.1”項色譜條件分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定,計算各成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸峰面積的RSD 值分別為1.1%、1.3%、1.0%和1.2%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3.8 重復(fù)性試驗取同一批當(dāng)歸六黃湯樣品(S5),平行制備6份供試品溶液,按“2.2.1”項色譜條件進樣測定,計算各成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD 值分別為1.3%、1.1%、1.2%和1.1%,表明方法重復(fù)性良好。

    2.3.9 加樣回收率試驗取當(dāng)歸六黃湯樣品(S1)約0.05 g,按“2.3.3”項方法制備供試品溶液6 份,每組分別精密加入含189.5 μg/mL 黃芩苷對照品溶液4 mL、186.2 μg/mL 鹽酸小檗堿對照品溶液4 mL、49.7 μg/mL鹽酸黃柏堿對照品溶液1 mL、25.1 μg/mL阿魏酸對照品溶液1 mL。按“2.2.1”項色譜條件測定,記錄色譜圖,計算黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸的平均加樣回收率分別為98.33%、101.40%、99.19%、97.11%,RSD 分別為1.7%、1.9%、1.5%、1.3%,均滿足2020年版《中國藥典》要求。

    2.3.10 15 批樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定取15 批當(dāng)歸六黃湯凍干粉,按指紋圖譜方法同時進行含量測定,計算樣品中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表3。15 批樣品中黃芩苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為10.99~18.82 mg/g、鹽酸小檗堿的為11.17~21.46 mg/g、鹽酸黃柏堿的為0.41~1.13 mg/g、阿魏酸的為0.28~0.58 mg/g。

    2.4 出膏率的測定

    取15批當(dāng)歸六黃湯凍干粉,按《中國藥典》水分測定法第二法(烘干法)測定水分,按公式“出膏率= 凍干粉質(zhì)量×(1-水分)/飲片投料量×100%”計算出膏率,結(jié)果見表3。15 批當(dāng)歸六黃湯樣品的出膏率范圍為24.05%~33.89%。

    3 討論

    3.1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定指標(biāo)的選擇

    當(dāng)歸六黃湯經(jīng)典名方的制備采用水為溶劑進行煎煮,因此選擇各藥味中具有特征性的水溶性成分作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定指標(biāo)。據(jù)文獻報道,當(dāng)歸中的阿魏酸具有增強心肌的血液供應(yīng)、緩解心肌缺血的作用[9];黃芩中的黃芩苷具有抗氧化、清除自由基、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用[10];黃連中的鹽酸小檗堿具有抗菌、抗病毒等作用[11];黃柏中的鹽酸黃柏堿在降血壓、抗腎炎、抑制細胞免疫反應(yīng)等方面均具有顯著效果[12]。以上這些代表成分均是水溶性成分,因此,本研究選擇它們作為質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定指標(biāo)。

    3.2 指紋圖譜和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法的考察

    采用PDA 模式下通過對比不同波長的色譜圖,發(fā)現(xiàn)在檢測波長285 nm 下,當(dāng)歸六黃湯凍干粉供試品溶液檢測所得色譜峰信息更豐富,其中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4個成分峰響應(yīng)較高,分離度較好,故最終確定以285 nm 作為指紋圖譜和質(zhì)量分?jǐn)?shù)方法的檢測波長。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法考察中,供試品的制備方法分別考察了不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、30%甲醇、水)、提取方式(功率500 W、頻率40 kHz 超聲30 min 和210 r/min振搖30 min)、提取時間(10、20、30 min)對當(dāng)歸六黃湯中黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,并進行了方法學(xué)考察,最終確定了合適的供試品制備方法。

    圖3 專屬性試驗色譜圖Figure 3 Chromatograms of specificity

    表3 15批當(dāng)歸六黃湯凍干粉的出膏率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果Table 3 Results of yield and content of 15 batches of Danggui Liuhuang Decoction freeze?dried powder

    3.3 當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)研究

    本研究制備的15 批當(dāng)歸六黃湯樣品的出膏率范圍為24.05%~33.89%,平均出膏率為(28.61±8.58)%,15 批樣品的出膏率都在均值的±30%范圍內(nèi),表明3 個產(chǎn)地的不同批次藥材質(zhì)量均一穩(wěn)定。采用超高效液相色譜法建立了15 批樣品的UPLC指紋圖譜,并按照2020年版《中國藥典》分析方法驗證指導(dǎo)要求完成了系統(tǒng)的方法學(xué)考察,通過15批樣品確定了20 個共有峰。20 個共有峰歸屬于除佐藥黃芪外的六味藥材:峰1 為當(dāng)歸、生地黃、熟地黃的共有峰,峰2 歸屬于熟地黃,峰3 為黃芩和黃柏的共有峰,峰4 為黃芩、黃連、黃柏的共有峰,峰5 歸屬于黃柏,峰6 為黃連和黃柏的共有峰,峰7、8 為黃芩、黃連、黃柏的共有峰,峰9 歸屬于黃連、黃柏,峰10、11、12 歸屬于黃連,峰13 歸屬于黃芩,峰14、15 歸屬于黃連,峰16、17、18、19、20均歸屬于黃芩。通過測定15批樣品的黃芩苷、鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿、阿魏酸4 個成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)河北與山東產(chǎn)地黃芩的黃芩苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,山西產(chǎn)地的較低;重慶與四川產(chǎn)地的黃連中鹽酸小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高,山西產(chǎn)地的較低;表明不同產(chǎn)地的藥材質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間有一定的差異。

    指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分含量測定是對經(jīng)典名方復(fù)方制劑進行整體質(zhì)量評價的一種重要手段[13],本研究建立了經(jīng)典名方當(dāng)歸六黃湯多指標(biāo)成分含量測定與指紋圖譜方法,該方法可用于當(dāng)歸六黃湯物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制。黃芪為本方中的佐藥,但黃芪皂苷類成分紫外光譜為末端吸收,受其他藥味干擾較大,故本研究未能建立黃芪指紋圖譜及含量測定方法。

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