多指標(biāo)綜合評(píng)分法結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)選參棗滴丸的水提工藝

王佳雪，劉渠，2，3，簡(jiǎn)尚宇，胡濤，2，3，梁生旺，2，3，王淑美，湯丹，2，3，張陸勇

（廣東藥科大學(xué)1.中藥學(xué)院；4.藥學(xué)院；5.新藥研發(fā)中心，廣東廣州510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東廣州510006；3.廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006）

參棗滴丸為本課題組在研中藥新藥，由廣棗、丹參、人參、降香等組成，具有理氣止痛、活血化瘀等功效，用于治療冠心病、心絞痛等病癥[1]。研究表明，廣棗的主要化學(xué)成分包括黃酮類、酚酸類等[2]，主要有效成分為沒(méi)食子酸，可明顯改善心肌梗死后心肌纖維化[3]。丹參中含有的主要化學(xué)成分為丹參酮ⅡA等丹參酮類脂溶性成分和丹酚酸B 等酚酸類水溶性成分[4]，丹酚酸B 對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化有明顯作用[5]。人參皂苷和多糖為人參主要有效成分，人參皂苷具有保護(hù)和改善心肌缺血的作用[6]。

中藥復(fù)方的臨床運(yùn)用多為湯劑，課題組前期通過(guò)綜合考慮參棗滴丸中各成分比例、性質(zhì)和藥理作用，初步確定了參棗滴丸的提取工藝為水煎，本研究以丹酚酸B[7]77、沒(méi)食子酸[7]45和人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）[7]8多組分指標(biāo)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用正交試驗(yàn)方法對(duì)提取時(shí)間、加水倍數(shù)和提取次數(shù)進(jìn)行考察，進(jìn)一步優(yōu)化參棗滴丸的提取工藝，為其后續(xù)研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC?20AT 高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社）；SQP 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；ME104 電子分析天平[梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司]；JJ500電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；KQ?300DZ 超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜級(jí)，瑞典Oceanpak公司）；超純水（屈臣氏集團(tuán)）；冰乙酸（色譜級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司）；磷酸（色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；正丁醇、95%乙醇、甲醇和NaOH（分析級(jí)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 試藥

人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703?201832）、人參皂苷Re 對(duì)照品（批號(hào)：110754?201827）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704?201827）、丹酚酸B 對(duì)照品（批號(hào)：11562?201716）、沒(méi)食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831?201605）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；丹參（批號(hào)：190101）、人參（批號(hào)：181202）、降香（批號(hào)：190201）均購(gòu)于廣州至信藥業(yè)股份有限公司；廣棗（批號(hào)：190426）購(gòu)于安徽亳州普潤(rùn)藥業(yè)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定

選擇丹酚酸B、沒(méi)食子酸和人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）為指標(biāo)成分，參考2020 年版《中國(guó)藥典》（一部），制定各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定方法，并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，建立的有效成分HPLC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定方法滿足檢測(cè)要求。

2.1.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：按配方比例稱取廣棗、丹參、人參、降香藥材飲片，加6 倍量水煎煮30 min，過(guò)濾，加無(wú)水乙醇至70%進(jìn)行醇沉，過(guò)濾，即得丹酚酸B 和沒(méi)食子酸供試品溶液。將此供試品溶液在60 ℃下旋干去除乙醇，加等量水溶解，等量水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇層，用1%NaOH溶液洗滌2 次，用正丁醇飽和水洗滌3 次，過(guò)濾，濾液于60 ℃旋干，加甲醇定容至5 mL，即得人參皂苷測(cè)定用供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取丹酚酸B（8.130 mg）、沒(méi)食子酸（10.43 mg）和人參皂苷（Rg1、Re、Rb1分別為8.310、8.400、8.100 mg）對(duì)照品，置于10 mL量瓶中，分別加入80%甲醇、甲醇、甲醇溶解、定容，分別制成0.813 0 mg/mL 丹酚酸B 對(duì)照品溶液、1.043 0 mg/mL 的沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液和人參皂苷混合對(duì)照品溶液（Rg1、Re、Rb1質(zhì)量濃度分別為0.207 8、0.210 0、0.202 5 mg/mL）。

陰性樣品溶液的制備：除對(duì)照藥材外，按配方比例稱取其他藥材飲片，與供試品溶液同法制備，即得陰性樣品溶液。

2.1.2 色譜條件

丹酚酸B色譜條件：FeiniGen C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），柱溫為20 ℃，流動(dòng)相為乙腈?0.1%磷酸（體積比22∶78），檢測(cè)波長(zhǎng)為286.0 nm，流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

沒(méi)食子酸色譜條件：FeiniGenXPeonyx AQ?C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），柱溫為25 ℃，流動(dòng)相為甲醇?0.3%冰乙酸（體積比1∶99），檢測(cè)波長(zhǎng)為270.0 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

人參皂苷Rg1、Re 和Rb1色譜條件：Agela Tech?nologies Venusil XBP C18（L）色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm），柱溫為30 ℃，流動(dòng)相為乙腈?0.1%磷酸（梯度洗脫，見表1），檢測(cè)波長(zhǎng)為203.0 nm，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 人參皂苷梯度洗脫程序Table 1 The gradient elution procedure of Ginsenoside

2.1.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.3.1 專屬性試驗(yàn)取各指標(biāo)功效成分的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各進(jìn)樣10 μL，方法專屬性考察結(jié)果見圖1。可見，供試品在與對(duì)照品相應(yīng)位置有對(duì)應(yīng)色譜峰，陰性樣品無(wú)干擾；丹酚酸B、沒(méi)食子酸、人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）基本上可達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論塔板數(shù)以沒(méi)食子酸峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，以丹酚酸B 和人參皂苷Rg1峰計(jì)應(yīng)不低于6 000；表明各方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of specificity test

2.1.3.2 線性范圍以“2.1.1”項(xiàng)對(duì)照品溶液為母液，稀釋制成一系列對(duì)照品溶液，吸取10 μL 進(jìn)行液相分析。以質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。

精密吸取1、2、5、8、10、15 μL 丹酚酸B 對(duì)照品溶液進(jìn)行分析，得丹酚酸B 線性回歸方程為y=10 007 958.67-43 931.23x，r=1.000，表明丹酚酸B對(duì)照品在0.813 0～12.20 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

取沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋定容至10 mL，制成質(zhì)量濃度分別為0.010 43、0.020 86、0.041 72、0.104 3、0.208 6 mg/mL 的一系列溶液，進(jìn)樣分析，得線性回歸方程為y=30 039 004.20x，r=0.999 9，沒(méi)食子酸對(duì)照品在濃度0.010 43～0.208 6 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密量取人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋定容至10 mL，制成系列人參皂苷混合對(duì)照品溶液，其中，人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度梯度為0.053 20、0.106 3、0.265 8、0.531 5、0.850 4、1.063 mg/mL，人參皂苷Re質(zhì)量濃度梯度為0.039 50、0.079 00、0.197 5、0.395 0、0.632 0、0.790 0 mg/mL，人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度梯度為0.040 60、0.081 10、0.202 8、0.405 5、0.648 8、0.811 0 mg/mL。得人參皂苷Rg1回歸方程y=3 494 935.74x，r=0.999 9；人參皂苷Re 回歸方程y=2 760 475.76x，r=0.999 9；人參皂苷Rb1回歸方程y=2 477 157.31x，r=0.999 9。表明人參皂苷Rg1、Re、Rb1分別在質(zhì)量濃度0.053 20～1.063 mg/mL、0.039 50～0.790 0 mg/mL、0.040 55～0.811 0 mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)平行制備6 份供試品，精密吸取10 μL 進(jìn)行液相分析，測(cè)得峰面積，求質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RSD值。結(jié)果顯示丹酚酸B、沒(méi)食子酸、人參皂苷樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為24.9、0.97、2.6 mg/g，RSD 值分別為2.44%、1.17%和4.12%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

2.1.3.4 精密度試驗(yàn)取已知濃度的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣3 d，每天1 次，記錄指標(biāo)成分的峰面積和RSD 值。結(jié)果顯示，供試品丹酚酸B、沒(méi)食子酸、人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）峰面積的RSD 值為1.05%、0.79%和1.23%（n=3），表明方法精密度良好。

2.1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一份供試品溶液，分別于0、2、4、8、10、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄6 次進(jìn)樣峰面積和RSD 值。結(jié)果顯示，丹酚酸B、沒(méi)食子酸、人參皂苷RSD值為0.47%、0.35%和2.04%（n=6），表明方法穩(wěn)定性良好。

2.1.3.6 加樣回收試驗(yàn)分別取含27 mg 丹參、60 mg 廣棗和657 mg 人參生藥量的供試品（n=6），對(duì)應(yīng)精密加入丹酚酸B、沒(méi)食子酸、人參皂苷混合對(duì)照品溶液1 mL，加70%乙醇定容至5 mL，搖勻，過(guò)濾，精密吸取10 μL 進(jìn)行液相分析，計(jì)算含量、加樣回收率及RSD 值（n=6）。結(jié)果顯示，丹酚酸B 平均加樣回收率為97.37%、RSD 值為3.01%，沒(méi)食子酸平均加樣回收率為100.8%、RSD 值為0.43%，人參皂苷（Rg1、Re、Rb1總量）的平均加樣回收率為91.31%、RSD值為1.60%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用正交試驗(yàn)優(yōu)選參棗滴丸的水提工藝，按處方比例稱取廣棗50 g、人參33 g、丹參33 g、降香33 g，以廣棗中沒(méi)食子酸、丹參中丹酚酸B、人參中人參皂苷總含量（Rg1、Re、Rb1總量）為指標(biāo)成分，以提取時(shí)間、加水倍數(shù)和提取次數(shù)為考察因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行工藝考察，因素水平及試驗(yàn)結(jié)果詳見表2-3。各指標(biāo)評(píng)分權(quán)重分別為廣棗占0.4、丹參占0.3、人參占0.3，綜合評(píng)分（Y）=0.4（A-Amin）/（Amax-Amin）+0.3（B-Bmin）/（Bmax-Bmin）+0.3（C-Cmin）/（Cmax-Cmin），其中A 為沒(méi)食子酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、B 為丹酚酸B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)、C 為人參皂苷Rg1、Re、Rb1總質(zhì)量分?jǐn)?shù)。方差分析見表4。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

可見，最佳工藝為A1B2C3，即煎煮時(shí)間30 min，8 倍量水，煎煮3 次；C（煎煮次數(shù)）對(duì)水提工藝的影響最大，但F 值小于F 臨界值，表明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于3 個(gè)因素的影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從工業(yè)生產(chǎn)成本和能源節(jié)約的角度考慮，最終確定水提工藝為每個(gè)因素的初始水平，即：加6倍量水，煎煮2次，每次30 min。

2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步驗(yàn)證工藝的可行性和合理性，按處方比例稱取廣棗50 g、人參33 g、丹參33 g、降香33 g，以上述確定的最佳提取工藝條件（6 倍量水，煎煮2 次，煎煮時(shí)間30 min），平行試驗(yàn)3 次，每組平行取2 份樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表5?？梢?，水提液中的丹酚酸B、沒(méi)食子酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和人參皂苷Rg1、Re、Rb1總質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本穩(wěn)定且與正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本吻合，表明該優(yōu)選工藝條件可行。

3 討論

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用方式多靶點(diǎn)、多層次[8]。若以單一成分指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)選，不能保證中藥復(fù)方整體質(zhì)量[9]；對(duì)指標(biāo)成分進(jìn)行合理的選擇和確定，是優(yōu)選提取工藝的關(guān)鍵[10?11]。研究表明，廣棗中沒(méi)食子酸、丹參中丹酚酸B 以及人參中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1等成分是治療心血管疾病的主要有效成分。因此，本研究選擇以上成分為指標(biāo)成分，基于多組分指標(biāo)和正交試驗(yàn)對(duì)參棗滴丸有效成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分的整體特點(diǎn)。

表3 參棗滴丸水提工藝的L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The L9（34）orthogonal test results of the water extraction process of Shenzao Dropping Pills

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis

表5 最佳水提工藝驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Validation test results of the best water extraction process w/(mg·g-1)

本研究基于參棗滴丸方中君臣佐使的組方配伍規(guī)律，對(duì)廣棗中沒(méi)食子酸、丹參中丹酚酸B以及人參中的人參皂苷（Rg1、Re、Rb1）作為權(quán)重指標(biāo)進(jìn)行量化[9]。此方中，三味藥均為治療冠心病的要藥，廣棗為君藥，其權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.4，丹參活血化瘀，人參大補(bǔ)元?dú)?，二者在方中功效均較強(qiáng)，因此權(quán)重系數(shù)均設(shè)為0.3。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，采用Hassan 法，對(duì)各指標(biāo)成分進(jìn)行歸一化處理，因三味藥組間指標(biāo)差值較大，因此用最大最小歸一化公式進(jìn)行計(jì)算，即di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin）[12]。

綜上，本研究?jī)?yōu)選的參棗滴丸水提工藝為：加6倍量水，煎煮2 次，每次30 min，經(jīng)驗(yàn)證合理可行，為參棗滴丸的質(zhì)量控制和后續(xù)開發(fā)研究提供了依據(jù)和參考，并為研究中藥復(fù)方提取工藝的優(yōu)化開拓了思路。