影響黑牛肝菌新菌株Np0193菌絲生長關鍵因素研究

丁李春

（寧德市農(nóng)業(yè)科學研究所 福建福安 355003）

黑牛肝菌［Phlebopus portentosud（Berk.&Broome）Boedijn.］，又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，隸屬擔子菌門（Basi diomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、牛肝菌目（Boletales）、小牛肝菌科（Boletinellaceae）、脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）[1]，目前普遍認為牛肝菌是一類與宿主樹根系共生形成外生菌根的真菌類群，迄今為止，絕大多數(shù)種類尚未見人工栽培形成子實體的報道[2]，僅有黑牛肝菌實現(xiàn)了人工栽培， 栽培菌株均從野生菌分離馴化而來，且種性退化快，必須不斷篩選新菌株，并掌握其生長所需營養(yǎng)及培養(yǎng)條件。 本試驗從碳源、氮源、溫度、pH、無機鹽、含水量等6個因素對黑牛肝菌新菌株Np0193 菌絲生長的影響進行了研究，為其高效栽培提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

黑牛肝菌菌株Np0193 系寧德市農(nóng)業(yè)科學研究所通過對野生黑牛肝菌組織分離篩選所得。

1.2 供試培養(yǎng)基

培養(yǎng)基1:葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀1 g，瓊脂 16 g，復合維生素 B 20 mg，水 1 000 mL；培養(yǎng)基2：發(fā)酵木屑70% ，玉米粉20%，豆粕8%，庶糖1%，石膏1%。

1.3 試驗方法

1.3.1 碳源試驗 以不加葡萄糖的培養(yǎng)基1 為對照，分別用等量的蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、果糖代替培養(yǎng)基1 中的葡萄糖作碳源， 觀測不同碳源對菌絲生長的影響。

1.3.2 氮源試驗 以不加蛋白胨的培養(yǎng)基1 為對照，分別用牛肉膏、酵母膏、乙酸銨、尿素代替培養(yǎng)基1 中的蛋白胨作氮源， 觀測不同氮源對菌絲生長的影響。

1.3.3 溫度試驗 以培養(yǎng)基1 為菌絲生長培養(yǎng)基，設置 24℃、26℃、28℃、30℃、32℃ 5個溫度梯度，觀測不同溫度對黑牛肝菌菌絲生長的影響

1.3.4 pH 試驗 以培養(yǎng)基1 為菌絲生長培養(yǎng)基，設置 pH 為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 6個梯度的基礎培養(yǎng)基（用 1 mol/L NaOH 和 1 mol/L HCl 調(diào)節(jié) pH，使用pH 計進行 pH 測量）[3]，觀測不同 pH 對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.3.5 無機鹽試驗 以培養(yǎng)基1 中不加無機鹽為對照，分別用等量的硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化鉀、氯化鈉、碳酸鈣代替培養(yǎng)基1 中的磷酸二氫鉀，觀測不同無機鹽對黑牛肝菌菌絲生長的影響。

1.3.6 培養(yǎng)料含水量試驗 將培養(yǎng)基2 的含水量調(diào)節(jié)至50%、55%、60%、65%、70%、75%分別裝入25 mm×200 mm 試管中, 每個處理 3個重復,0.147 MPa 滅菌2.5 h，接種后于28℃恒溫培養(yǎng),觀測不同含水量對菌絲生長的影響。

1.4 接種培養(yǎng)

碳源試驗、氮源試驗、無機鹽試驗、pH 試驗均于平板中央接種1 塊直徑6.5 mm 活化的菌絲塊，于28℃下恒溫培養(yǎng)， 溫度試驗則在設定的恒溫下培養(yǎng)，定期（7 d、10 d、13 d）用十字交叉法[4]測量菌落直徑，每個處理3 次重復。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性檢測用Excel 2007 和SPSS 17 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的影響

從表1 可以看出， 以可溶性淀粉為碳源黑牛肝菌Np0193 菌絲生長整齊、菌落完整，生長速度最快為2.92 mm/d，與對照差異顯著；以蔗糖、麥芽糖、果糖為碳源黑牛肝菌菌絲生長不整齊， 生長速度分別為 2.41 mm/d、2.35 mm/d、2.32 mm/d， 與對照差異顯著， 菌絲生長7～10 d 后顏色開始變成褐色并伴有深褐色分泌物產(chǎn)生，菌絲老化快。

表1 不同碳源對黑牛肝菌菌絲生長的影響

2.2 不同氮源對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的影響

從表2 可以看出， 在培養(yǎng)基1 中分別添加1 g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、乙酸銨、尿素，與對照相比其菌絲的長勢優(yōu)于未加氮源的培養(yǎng)基1。其中以蛋白胨、酵母膏為氮源的菌絲生長快且最為健壯，邊緣整齊， 顏色呈黃色， 生長速度分別為2.56 mm/d和2.50 mm/d， 與其他各處理菌絲生長速度相比差異顯著，說明蛋白胨是黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的最佳氮源，其次是酵母膏。 在培養(yǎng)基1 中添加1 g/L 尿素作氮源，培養(yǎng)20 d 菌絲仍未生長，說明尿素添加量在一定范圍內(nèi)對黑牛肝菌菌絲生長有抑制作用， 這與何明霞等[5]在氮源篩選時尿素抑制菌絲生長的結(jié)論相一致。

表2 不同氮源對黑牛肝菌菌絲生長的影響

2.3 不同溫度對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的影響

從表3 可以看出，溫度對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長作用十分明顯， 在24～32℃溫度下菌絲均能生長，30℃時菌絲生長速度最快， 達到 2.61 mm/d，到32℃時菌絲生長速度下降， 菌絲前端生長不整齊，菌絲顏色變深且易老化，接種塊處形成深褐色液狀分泌物；在24℃溫度下菌絲生長速度最慢，為1.51 mm/d。本試驗中黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的適宜溫度為28～30℃，這與羅順珍等[6]適宜黑牛肝菌菌絲生長的合成培養(yǎng)基及主要環(huán)境條件試驗中得出的黑牛肝菌菌絲適宜生長溫度為27～31℃的結(jié)論基本一致。

表3 不同溫度對黑牛肝菌菌絲生長的影響

2.4 pH 對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的影響

pH 是影響黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的主要因素之一。 從表4 可以看出，黑牛肝菌Np0193 菌絲生長適宜pH 為 4.5～5.5，最適為4.5，菌絲生長速度最快為2.72 mm/d，且菌絲濃密，黃色先端整齊；pH 低于4.0 或高于5.5 時，菌絲生長緩慢，菌絲索狀前端生長不整齊，易形成褐色菌核。

表4 不同pH 對黑牛肝菌菌絲生長的影響

2.5 無機鹽對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的影響

從表5 可以看出， 添加7種無機鹽均對菌絲的生長有抑制作用，且易出現(xiàn)菌絲老化、菌落褐色，菌絲生長速度均比對照慢， 但添加碳酸鈣時菌絲生長整齊且比對照菌絲粗壯。 加入氯化鈉時對菌絲的抑制作用最為顯著，生長速度為1.5 mm/d，與對照差異顯著。 添加1 g/L 無機鹽對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長影響較大， 不同無機鹽添加量對其生長的影響有待進一步研究。

表5 不同無機鹽對黑牛肝菌菌絲生長的影響

2.6 培養(yǎng)料含水量對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長的影響

從表6 可以看出，黑牛肝菌Np0193 菌絲生長適宜含水量為55%～65%，最適為60%；低于50%或高于70%時菌絲生長緩慢、菌絲稀疏、抗逆性差，菌絲索狀前端生長不整齊。

表6 不同含水量對黑牛肝菌菌絲生長的影響

3 結(jié)論與討論

黑牛肝菌是新興的優(yōu)質(zhì)珍稀食用菌， 其菌絲生長關鍵因素、 遺傳育種和高產(chǎn)栽培技術等方面的研究在我國的報道尚不多見[7]。 目前黑牛肝菌人工栽培的菌株是從野生菌分離馴化而來，且種性退化快，必須不斷篩選新菌株， 并掌握其生長所需營養(yǎng)及培養(yǎng)條件。本試驗從碳源、氮源、溫度、pH、無機鹽、含水量等6個因素對黑牛肝菌新菌株Np0193 菌絲生長的影響進行了研究，為其高效栽培提供理論基礎。

試驗結(jié)果表明，黑牛肝菌新菌株Np0193 菌絲生長最適碳源是可溶性淀粉， 菌絲生長整齊、 菌落完整，生長速度為2.92 mm/d；適宜氮源為蛋白胨、酵母膏，菌絲生長快且健壯，邊緣整齊，顏色呈黃色，生長速度分別為2.56 mm/d 和2.50 mm/d； 溫度對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長作用十分明顯，在24～32℃溫度下菌絲均能生長，最適溫度為28～30℃，30℃時菌絲生長速度最快，達到 2.61 mm/d；適宜 pH 為 4.5～5.5，最適為4.5，菌絲生長速度最快為2.72 mm/d，且菌絲濃密，黃色先端整齊，常規(guī)PDA 培養(yǎng)基pH 6.0 左右不適合黑牛肝菌Np0193 菌絲生長； 添加1 g/L 無機鹽均對菌絲的生長有抑制作用，且易出現(xiàn)菌絲老化、菌落褐色，菌絲生長速度均比對照慢，降低無機鹽的添加量是否對其菌絲生長有促進作用還有待于進一步研究；適宜含水量為55%～65%，最適為60%，低于50%或高于70%時菌絲生長緩慢、菌絲稀疏、抗逆性差。

液體菌種在生產(chǎn)上的應用是食用菌工廠化生產(chǎn)的必然趨勢[8]。 黑牛肝菌對營養(yǎng)物質(zhì)的需求及培養(yǎng)條件的要求比較嚴格，菌種在固體培養(yǎng)基上生長緩慢，縮短菌種培養(yǎng)時間迫在眉睫。 本試驗對黑牛肝菌Np0193 菌絲生長營養(yǎng)物質(zhì)及關鍵條件進行了研究，為其液體菌種的開發(fā)提供了依據(jù)。