Th17/Treg細(xì)胞比例、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因多態(tài)性與慢性阻塞性肺疾病患者臟腑虛損的相關(guān)性研究*

廖春燕，徐丹，王娜娜

（1. 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，新疆烏魯木齊 830099；2.新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)臨床研究基地，新疆烏魯木齊 830099）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種慢性氣道炎癥疾病[1]，其特征表現(xiàn)為氣流受限且呈進(jìn)行性加重，并伴有肺部異常炎癥反應(yīng)[2]。COPD 患者通常會(huì)出現(xiàn)肺通氣和彌散功能障礙，并損害呼吸和循環(huán)功能，易導(dǎo)致患者出現(xiàn)呼吸衰竭，嚴(yán)重者可導(dǎo)致患者死亡[3]。COPD 在中醫(yī)學(xué)上屬于“肺脹”“喘證”范疇，久病可累及肺、腎、脾，因此，COPD 穩(wěn)定期以肺、腎、脾氣血虧虛為主，中醫(yī)分型分為肺腎氣虛證和肺脾氣虛證，發(fā)病首先在肺部，隨著病情進(jìn)展，逐漸累及脾腎，晚期累及心臟[4]。臨床研究表明[5]，在COPD 發(fā)病及疾病進(jìn)展中，T 細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)及肺血管系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用，而誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）基因多態(tài)性與很多心血管疾病相關(guān)。因此，探究影響COPD 患者臟腑虛損的相關(guān)因素，對(duì)臨床加強(qiáng)疾病監(jiān)測(cè)和預(yù)防，并及時(shí)進(jìn)行治療干預(yù)具有重要價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外[6-8]對(duì)COPD 的研究大多針對(duì)其吸入激素、聯(lián)合用藥治療方式及預(yù)后等方面，很少研究T 細(xì)胞和iNOS基因多態(tài)性與COPD 的相關(guān)性。因此，本研究對(duì)COPD 穩(wěn)定期患者進(jìn)行研究，旨在探討輔助性T 細(xì)胞17/調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T helper cell 17/regulatory T cell,Th17/Treg）細(xì)胞比例、iNOS基因多態(tài)性與COPD 患者臟腑虛損的相關(guān)性，為臨床準(zhǔn)確判斷患者病情，改善治療效果提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2020年1月新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院收治的130 例COPD 穩(wěn)定期患者。根據(jù)患者疾病所屬中醫(yī)證型，分為肺脾氣虛組67 例和肺腎氣虛組63 例。另選同期該院健康體檢者60 例作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均診斷為COPD，且處于穩(wěn)定期[9]；②中醫(yī)辯證分型符合肺脾氣虛和肺腎氣虛型[4]；③不存在意識(shí)異常；④年齡60 周歲以上；⑤依從性好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肺癌；②伴有免疫、造血系統(tǒng)疾??；③伴有重要臟器嚴(yán)重病變或功能障礙；④伴有呼吸衰竭、氣胸、胸腔積液等。研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 肺功能檢測(cè)

所有患者及健康體檢者入院后均采用肺功能檢測(cè)儀（MasterScreen，德國(guó)耶格公司）檢測(cè)用力肺活量（forced vital capacity, FVC）、第1 秒鐘用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second, FEV1）、第1 秒鐘用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in one second to forced vital capacity ratio,FEV1%）。

1.3 血清Th17/Treg細(xì)胞檢測(cè)

所有受試者均于入院第2 天早晨空腹時(shí)采集靜脈血5 mL，將其在室溫下靜置30 min，分層出現(xiàn)血清時(shí)，置于離心機(jī)中，3 000 r/min 離心10 min 后吸取上層血清，于-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍保存。采用流式細(xì)胞儀（型號(hào)：BD Accuri?C6，美國(guó)BD 公司）檢測(cè)血清Th17、Treg 細(xì)胞變化。

1.4 iNOS基因檢測(cè)

所有患者均于入院后第二天早晨空腹時(shí)采集靜脈血3 mL，用乙二胺四乙酸進(jìn)行抗凝并混勻，儀器采用基因芯片檢測(cè)儀（型號(hào)：GENEPIX 4000B，美國(guó)AXON 公司）、生物芯片識(shí)讀儀（型號(hào)：BE-2.0，上海百傲科技有限公司）。采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）將iNOS 基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并將基因芯片與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行混勻雜交，再倒入顯色液，然后將其放置在生物芯片識(shí)讀儀上進(jìn)行檢測(cè)，采用Array Doctor 軟件進(jìn)行圖像分析并生成iNOS 基因多態(tài)性基因位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo)

①肺功能。②血清Th17、Treg、Th17/Treg 細(xì)胞比例。③Th17/Treg 細(xì)胞比例與COPD 臟腑虛損的相關(guān)性。④iNOS 基因型頻率和等位基因頻率。⑤iNOS 基因多態(tài)性與COPD 臟腑虛損的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或者方差分析；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或例表示，比較用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson 法；多因素Logistic 回歸分析相關(guān)影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料

3 組性別構(gòu)成、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肺脾氣虛組和肺腎氣虛組病程比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），均具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 3組一般資料比較

2.2 3 組肺功能的比較

3組FVC、FEV1比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肺脾氣虛組和肺腎氣虛組患者的FVC、FEV1低于對(duì)照組（P＜0.05），肺脾氣虛組患者FVC、FEV1大于肺腎氣虛組（P＜0.05）。3組FEV1%比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 3組肺功能的比較 （±s）

表2 3組肺功能的比較 （±s）

注：①與肺脾氣虛組比較，P ＜0.05；②與肺腎氣虛組比較，P ＜0.05。

FEV1%0.62±0.33 0.61±0.31 0.84±0.42 1.254 0.062組別肺脾氣虛組肺腎氣虛組對(duì)照組F 值P 值n 67 63 60 FVC/L 0.81±0.21 0.68±0.17①1.12±0.15①②5.254 0.017 FEV1/L 0.64±0.13 0.42±0.14①0.82±0.14①②6.547 0.012

2.3 3組血清Th17、Treg及Th17/Treg的比較

3 組Th17、Treg 及Th17/Treg 比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肺脾氣虛組和肺腎氣虛組患者的Th17、Th17/Treg 高于對(duì)照組（P＜0.05），Treg 低于對(duì)照組（P＜0.05），肺脾氣虛組患者Th17、Th17/Treg 低于肺腎氣虛組（P＜0.05），Treg 高于肺腎氣虛組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 3組血清Th17、Treg 及Th17/Treg的比較（±s）

表3 3組血清Th17、Treg 及Th17/Treg的比較（±s）

注：①與肺脾氣虛組相比較，P ＜0.05；②與肺腎氣虛組比較，P ＜0.05。

Th17/Treg 2.02±0.73 4.61±1.35①0.52±0.14①②11.325 0.000組別肺脾氣虛組肺腎氣虛組對(duì)照組F 值P 值n 67 63 60 Th17/%4.51±1.08 6.42±1.61①1.29±0.45①②9.254 0.005 Treg/%2.56±0.62 1.53±0.54①4.26±1.06①②10.547 0.000

2.4 Th17/Treg 與肺功能、肺脾氣虛、肺腎氣虛的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，Th17/Treg 與FVC、FEV1、FEV1%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.407、-0.438 和-0.504，P=0.018、0.015 和0.008），與肺脾氣虛、肺腎氣虛呈正相關(guān)（r=0.321 和0.565，P=0.032 和0.009）。

2.5 3組iNOS基因型頻率和等位基因頻率比較

3 組誘導(dǎo)型iNOS 基因型頻率和等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），肺脾氣虛組和肺腎氣虛組患者GG 基因型頻率低于對(duì)照組（P＜0.05），TT 基因型頻率高于對(duì)照組（P＜0.05），T 等位基因頻率高于對(duì)照組（P＜0.05）；肺脾氣虛組GG 基因型頻率高于肺腎氣虛組（P＜0.05），TT 基因型頻率低于肺腎氣虛組（P＜0.05），T 等位基因頻率低于肺腎氣虛組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 3組iNOS基因型頻率和等位基因頻率的比較 例

2.6 COPD臟腑虛損的多因素Logistic回歸分析

以臟腑虛損為因變量（1=肺脾氣虛，2=肺腎氣虛），以上述單因素分析中P＜0.05 的變量即FVC（1 = ≥80%，2=＜80%）、FEV1（1=≥50%，2=＜50%）、血清Th17（= ≥5.15%，2 = ＜5.15%）、Treg（1 = ≥1.94%，2 = ＜1.94%）、Th17/Treg（1=≥2.74，2=＜2.74）及iNOS 基因多態(tài)性（1 =TT，2 =GT，3 =GG）中P＜0.1 的因素為自變量（其中連續(xù)變量的自變量以中位數(shù)法轉(zhuǎn)化為二分類(lèi)），采用多因素Logistic 回歸分析COPD 臟腑虛損的影響因素，結(jié)果顯示，iNOS 基因多態(tài)性中TT 基因型是影響COPD 臟腑虛損的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

COPD 是以慢性支氣管炎和肺氣腫為主要臨床表現(xiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病[10]，其病理學(xué)機(jī)制在于肺實(shí)質(zhì)、肺血管及氣道壁出現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)損傷，以及慢性炎癥反應(yīng)，主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、咳痰、氣短或呼吸困難以及喘息胸悶等，直接累及肺部，也可引起全身反應(yīng)[11]。COPD 穩(wěn)定期在中醫(yī)學(xué)上表現(xiàn)為肺脾、肺腎虛損，其中肺腎虛損是COPD 進(jìn)展到嚴(yán)重病癥的標(biāo)志[12]。因此，對(duì)COPD 患者不同臟腑虛損狀態(tài)的相關(guān)影響因素進(jìn)行分析有助于及時(shí)評(píng)估疾病進(jìn)展及采取治療干預(yù)。而臨床研究表明[13]，在多種自身免疫性、慢性感染性疾病免疫調(diào)節(jié)以及COPD 發(fā)病機(jī)制中均有Th17、Treg 的參與。另外，臨床研究發(fā)現(xiàn)，肺血管系統(tǒng)對(duì)COPD 發(fā)病也具有重要作用，iNOS 使肺血管阻力維持正常，并且抑制肺動(dòng)脈重建，因此iNOS 基因多態(tài)性對(duì)NOS轉(zhuǎn)錄及表達(dá)可能產(chǎn)生影響，從而影響COPD 疾病進(jìn)展。因此，探究Th17/Treg 細(xì)胞比例、iNOS 基因多態(tài)性與COPD 患者臟腑虛損的相關(guān)性，對(duì)臨床準(zhǔn)確預(yù)測(cè)及評(píng)估患者病情，選擇合理治療方案，及時(shí)干預(yù)具有重要臨床意義。

Th17 是一種T 細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病和機(jī)體免疫反應(yīng)中均有參與[14]。Treg 在各種免疫細(xì)胞亞群中通過(guò)細(xì)胞間接接觸和分泌抑制性細(xì)胞因子T細(xì)胞亞群，對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用，抑制機(jī)體免疫反應(yīng)和對(duì)自身抗原的主動(dòng)耐受[15]。Th17 與Treg 在功能上具有拮抗效應(yīng)，維持Th17/Treg 細(xì)胞比例的平衡有助于促進(jìn)免疫穩(wěn)定和防止炎癥反應(yīng)的發(fā)生[16]。門(mén)翔等[17]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者外周血Th17/Treg 比值與患者肺功能下降具有顯著的相關(guān)性，并且肺功能指標(biāo)FVC、FEV1、FEV1%與外周血中Th17 細(xì)胞、Th17/Treg 比值呈負(fù)相關(guān)。林琳等[18]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，COPD 穩(wěn)定期組患者外周血Th17/Treg 比值顯著高于健康組，且Th17、Treg 和Th17/Treg 與FEV1%/預(yù)計(jì)值和FEV1%均呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肺脾氣虛組患者Th17、Th17/Treg 顯著低于肺腎氣虛組，Treg 顯著高于肺腎氣虛組，Th17/Treg 細(xì)胞比例與肺功能呈負(fù)相關(guān)性，與臟腑虛損程度呈正相關(guān)，且隨著COPD 臟腑虛損程度加深，相關(guān)性顯著增加，表明隨著Th17/Treg細(xì)胞比例上升，COPD 患者肺功能降低，臟腑虛損程度加深，原因可能在于COPD 是肺部慢性炎癥反應(yīng)，隨著疾病進(jìn)展，由肺脾氣虛進(jìn)入肺腎氣虛，患者肺功能進(jìn)一步下降，臟腑虛損程度加重，全身炎癥癥狀也加劇，引起病理性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致Th17 上升，Treg 下降，因此Th17/Treg 細(xì)胞比例增加。這與門(mén)翔等[17]、林琳等[18]學(xué)者研究結(jié)論相似。

一氧化氮屬于一類(lèi)交感神經(jīng)阻滯劑，對(duì)興奮性交感神經(jīng)元活動(dòng)以及心臟對(duì)交感神經(jīng)刺激反應(yīng)具有削弱作用，并且能夠增強(qiáng)心臟對(duì)迷走神經(jīng)刺激的反應(yīng)，抑制血管平滑肌增生，在多種心血管疾病的發(fā)展中均發(fā)揮了重要作用[19]。NOS 屬于一種存在于神經(jīng)元中的同工酶，包括神經(jīng)型、內(nèi)皮型和誘導(dǎo)型，在成熟肺中均有產(chǎn)生[20]。吳紀(jì)珍等[21]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因G894T 多態(tài)性[T∶G：=1.377（95%CI：1.112，1.704）；GT∶GG：=1.397（95% CI：1.179，1.656）；TT+GT∶GG：=1.415（95% CI：1.201，1.668）]多態(tài)性均可增加靜脈血栓栓塞癥患病風(fēng)險(xiǎn)，eNOS 基因G894T 多態(tài)性與靜脈血栓栓塞癥易感性相關(guān)。諸國(guó)華等[22]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，G894T 的TT 基因型高血壓易感性較GG 基因型更高，eNOS基因多態(tài)性與高血壓導(dǎo)致的靶器官損害、急性冠脈綜合征存在相關(guān)性，G894T的T 等位基因攜帶者動(dòng)脈內(nèi)膜增厚患病率更高。本研究結(jié)果顯示，肺脾氣虛組T 等位基因頻率顯著低于肺腎氣虛組，且肺脾氣虛組和肺腎氣虛組均高于健康對(duì)照組，提示T 等位基因與COPD 臟腑虛損存在相關(guān)性，并且iNOS 基因多態(tài)性中TT 基因型是影響COPD 臟腑虛損的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與COPD 臟腑虛損呈正相關(guān)，且隨著COPD 臟腑虛損程度加深，相關(guān)性顯著增加，表明iNOS 基因多態(tài)性與著COPD 患者臟腑虛損具有明顯相關(guān)性，其中TT 基因型能明顯加重患者臟腑虛損程度，原因可能在于iNOS 基因多態(tài)性會(huì)影響一氧化氮釋放水平，其中TT 基因型患者一氧化氮水平最低。隨著COPD 發(fā)生，患者肺功能降低，使得iNOS 功能障礙以及活性降低，導(dǎo)致一氧化氮水平降低，患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，進(jìn)一步加劇患者肺部及全身炎癥反應(yīng)，并且iNOS 基因多態(tài)性通過(guò)影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和激肽系統(tǒng)，使得肺動(dòng)脈收縮重構(gòu)，引起肺、脾、腎等臟腑虛損程度進(jìn)一步加重，這與吳紀(jì)珍等[21]、諸國(guó)華等[22]學(xué)者研究結(jié)論相似。

綜上所述，Th17/Treg 細(xì)胞比例與iNOS 基因多態(tài)性與COPD 患者臟腑虛損均具有明顯相關(guān)性，且Th17/Treg 細(xì)胞比例隨著患者臟腑虛損進(jìn)展，呈正相關(guān)，并且iNOS 基因多態(tài)性中TT 基因型是影響COPD 臟腑虛損的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。