電針對(duì)慢性應(yīng)激抑郁大鼠犬尿氨酸代謝途徑的影響*

宋洪濤，武忠，賽音朝克圖，羅彤，趙俊

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010065；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，北京 100029）

抑郁癥作為一種情緒障礙疾病，多表現(xiàn)為情緒改變、興趣低下、自卑感、不愿與他人交流及自殺傾向。研究證實(shí)，大腦各個(gè)區(qū)域的5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）水平的降低與抑郁癥的發(fā)生具有相關(guān)性[1-2]。臨床上多種抗抑郁藥的作用機(jī)制多基于抑郁癥的單胺假說，但是三分之一的患者對(duì)常規(guī)藥物療法沒有明顯效果[3]，因此有必要進(jìn)一步闡明抑郁癥的生物學(xué)機(jī)制。近年來，學(xué)者發(fā)現(xiàn)犬尿氨酸途徑代謝異常在抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著作用[4-5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，犬尿氨酸代謝分為兩個(gè)主要途徑，一方面，犬尿氨酸被犬尿氨酸轉(zhuǎn)氧酶（kynurenine aminotransferase, KAT）催化生成犬尿喹啉酸（kynurenic acid, KYNA），KYNA具有神經(jīng)保護(hù)作用；另一方面，犬尿氨酸在犬尿氨酸-3- 單加氧酶（kynurenine-3-monooxygenase,KMO）、3-羥基鄰氨基苯甲酸3，4-雙加氧酶（3-hydroxyanthranilate 3,4-dioxygenase, 3-HAO）的作用下轉(zhuǎn)換為喹啉酸（quinolinic acid, QUIN），QUIN 可引起神經(jīng)元的損害。具有神經(jīng)毒性和神經(jīng)保護(hù)作用的代謝物含量之間的不平衡可能是抑郁癥的主要驅(qū)動(dòng)因素。本次研究采用普遍認(rèn)可的慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)方法復(fù)制大鼠抑郁模型，基于犬尿氨酸途徑探討抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，以明確電針在治療抑郁癥中的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)雄性SD 大鼠，體重（200±10）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006]。購進(jìn)大鼠后實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1 周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，通過敞箱試驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，剔除不符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠（行為靜止或過于活躍）。選取24 只大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、氟西汀組、電針組，每組6 只。

1.2 儀器與試劑

7500 Real-Time PCR 儀、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（美國Bio-Rad 公司），數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（中國BINTA公司），Image-Pro Plus Analysis Soft ware 計(jì)算機(jī)圖像分析儀（美國Bio-Rad 公司），低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Scientific 公司），電子天平BS224S（德國Sartouris 公司），核酸紫外分光光度計(jì)（德國Biophotometer 公司），LH202 型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司）。QUIN ELISA 試劑盒（貨號(hào)：L190408618）購自北京奇景融生物技術(shù)有限公司，KYNA ELISA 試劑盒（貨號(hào)：L190408621）購自北京奇景融生物技術(shù)有限公司。

1.3 慢性應(yīng)激抑郁模型的復(fù)制

采用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)的方式進(jìn)行抑郁模型復(fù)制[6-7]。應(yīng)激刺激方法：24 h 禁食、禁水，5 min 4℃冰水游泳，24 h 潮濕環(huán)境、晝夜顛倒，3 min 夾尾（距離尾尖2 cm），3 h 束縛。模型復(fù)制共進(jìn)行21 d，按照隨機(jī)抽簽順序，保證每種應(yīng)激平均應(yīng)用3 次，每天應(yīng)用1 種應(yīng)激方式。

1.4 各組大鼠干預(yù)方法

空白組：正常群養(yǎng)，不采取任何干預(yù)措施；模型組：單籠孤養(yǎng)結(jié)合模型復(fù)制應(yīng)激；氟西汀組：單籠孤養(yǎng)結(jié)合模型復(fù)制應(yīng)激，應(yīng)激前1 h 予灌胃給藥（鹽酸氟西汀以生理鹽水配制成1 mg/mL 濃度，2 mg/kg 給藥）；電針組：單籠孤養(yǎng)結(jié)合模型復(fù)制應(yīng)激，應(yīng)激前1 h予電針百會(huì)穴和印堂穴（頻率為2 Hz，電流強(qiáng)度為1 mA，20 min/次，1 次/d）。

1.5 開野試驗(yàn)

對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測，箱體規(guī)格為80 cm×80 cm×40 cm，箱體內(nèi)部均涂成黑色，箱底用白線劃分成25 個(gè)等邊方格。檢測時(shí)，捏提大鼠尾端，待大鼠情緒穩(wěn)定后，輕置于中心方格內(nèi)，統(tǒng)計(jì)5 min 內(nèi)大鼠穿過等邊方格的次數(shù)（水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)）和大鼠后肢直立次數(shù)（垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)），開野試驗(yàn)[8]分別在實(shí)驗(yàn)前1 天以及實(shí)驗(yàn)第22 天各進(jìn)行1 次。

1.6 標(biāo)本制備及檢測方法

1.6.1 大鼠海馬KYNA、QUIN 含量檢測各組大鼠腹腔注射麻醉（10%水合氯醛，380 mg/kg），迅速斷頭，在超凈臺(tái)冰上剝離取海馬組織，放入滅菌離心管中，置入-80℃保存。嚴(yán)格按照試ELISA 劑盒說明書對(duì)大鼠海馬區(qū)KYNA、QUIN 進(jìn)行檢測。

1.6.2 qRT-PCR 檢測大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA 相對(duì)表達(dá)量取20 mg海馬組織，置于加入液氮的研缽中快速研磨，將粉末裝入EP 管；加入1 mL Trizol 液，用槍頭吹打混勻，室溫放置5 min；以1∶1 Trizol 液的比例加入氯仿，搖蕩離心管15 s，室溫放置2～3 min；4℃12 000 r/min離心15 min，取上層水，按1∶2 Trizol 液的比例加入異丙醇，室溫放置20 min；4℃12 000 r/min 離心10 min，棄上清，按1∶1 Trizol 液的比例加入75%乙醇（DEPC配制）；4℃7 500 r/min 離心5 min，棄上清，室溫干燥3 min；DEPC 水溶解沉淀得總RNA；通過核酸紫外光譜法測定RNA 濃度，在20 μL 系統(tǒng)中將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。配制逆轉(zhuǎn)錄體系：RNA 5 μL、Oligo（dT）2 μL、ddH2O（DEPC 處理） 4.5 μL，首先70℃孵育5 min，然后迅速放在冰上。5×Buffer 5 μL、dNTP（10 mmol）2 μL、Ribonuclease inhibitor 0.5 μL、MMLV RT 1 μL。42℃孵育60 min，然后70℃10 min；用所得的cDNA 構(gòu)建qRT-PCR 體系：cDNA 2 μL、引物1（10 pmol/μL）0.5 μL、引物2 （10 pmol/μL）0.5 μL、SYBR mix 10 μL、dd H2O 7 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸10 min，共40 個(gè)循環(huán)。繪制熔解曲線，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法分析結(jié)果。KMO 引物：正向5'-TCCCTTCCACCTGAAGTCAC-3'，反向5'-AGTCTTCA AAGCCCGCATTC-3'；3-HAO 引物：正向5'-AGGTGA CAATGGGAGGACAG-3'，反向5'-TTACAGGCAGGGT CTTGTGT-3'。KAT 引物：正向5'-GCCTTGTTCACAG CCTTTCA-3'，反向5'-ACCTCCAGCCATCATTGTCA-3'；GAPDH 引物：正向5′-CAACTCCCTCAAGATTGT CAGCAA-3′,反向5′-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠抑郁行為學(xué)變化

模型組大鼠應(yīng)激前的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)與應(yīng)激后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組、氟西汀組、電針組大鼠應(yīng)激前的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)與應(yīng)激后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；應(yīng)激前4 組大鼠水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；應(yīng)激刺激21 d 后4 組大鼠水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)較空白組減少（P＜0.05），氟西汀組、電針組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)次數(shù)、垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)較模型組升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠開野試驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠開野試驗(yàn)水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)次數(shù)比較 （n=6，±s）

注：①應(yīng)激后與空白組比較，P＜0.05；②應(yīng)激后與模型組比較，P ＜0.05。

組別水平運(yùn)動(dòng)垂直運(yùn)動(dòng)應(yīng)激前71.66±7.31 75.66±11.11 72.16±16.63 72.00±13.41 0.133 0.939應(yīng)激后61.33±19.36 41.83±5.56①58.33±6.71②67.67±15.02②4.182 0.019空白組模型組氟西汀組電針組F 值P 值t 值0.000 0.000 0.000 0.000 P 值0.239 0.002 0.181 0.567應(yīng)激前11.5±4.59 13.67±6.53 12.83±4.70 14.5±4.41 0.652 0.774應(yīng)激后17.33±2.50 6.50±2.66①12.33±2.06②12.66±2.94②17.970 0.000 t 值0.000 0.000 0.000 0.000 P 值0.058 0.030 0.822 0.493

2.2 各組大鼠KYNA、QUIN比較

4 組大鼠KYNA 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組大鼠海馬KYNA 含量較空白組降低（P＜0.05），電針組大鼠海馬KYNA含量較模型組升高（P＜0.05）；4 組大鼠QUIN 含量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組大鼠海馬QUIN 含量較空白組升高（P＜0.05），氟西汀組和電針組大鼠海馬QUIN 含量較模型組降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠KYNA、QUIN比較（n=6，ng/mL，±s）

表2 各組大鼠KYNA、QUIN比較（n=6，ng/mL，±s）

組別空白組模型組氟西汀組電針組F 值P 值KYNA 51.91±5.34 43.79±3.94 46.09±4.86 50.23±4.21 3.902 0.024 QUIN 4.82±0.43 5.98±0.86 5.01±0.44 5.27±0.44 4.702 0.012

2.3 各組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

4 組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組大鼠較空白組升高（P＜0.05），氟西丁組和電針組較模型組降低（P＜0.05）；4 組大鼠海馬KAT mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組較空白組降低（P＜0.05），氟西汀組和電針組較模型組升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

表3 各組大鼠海馬KMO mRNA、3-HAO mRNA、KAT mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （n=6，±s）

組別空白組模型組氟西汀組電針組F 值P 值KMO mRNA 1.01±0.15 2.04±0.38 1.55±0.46 0.98±0.28 13.210 0.000 3-HAO mRNA 1.01±0.18 2.32±0.16 1.73±0.34 1.62±0.18 32.907 0.000 KAT mRNA 2.00±0.34 1.58±0.46 2.55±0.23 2.38±0.24 10.437 0.000

3 討論

色氨酸是一種用于蛋白質(zhì)生物合成的必需氨基酸，也是5-HT 和犬尿氨酸的前體。5-HT 的減少和抑郁癥關(guān)系密切；同時(shí)犬尿氨酸代謝途徑是色氨酸分解代謝的主要途徑。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，犬尿氨酸代謝途徑是由吲哚氨-2,3-雙加氧酶（Indoleamine-2,3-dioxygenases, IDO）降解色氨酸引發(fā)的。當(dāng)IDO 被激活后，犬尿氨酸代謝途徑分為兩個(gè)主要途徑，一個(gè)涉及神經(jīng)保護(hù)作用的Trp-KYNA 途徑，即犬尿氨酸被KAT 催化生成KYNA；另一個(gè)涉及神經(jīng)毒性的Trp-NAD+途徑，即犬尿氨酸在KMO、3-HAO 的作用下轉(zhuǎn)換為QUIN[9-10]。在生理?xiàng)l件下，色氨酸分別在5-羥色胺能神經(jīng)元中代謝為5-HT，在星形膠質(zhì)細(xì)胞中代謝為KYNA，作為NMDA 和a7nACh 受體拮抗劑，KYNA 可以發(fā)揮抗興奮和抗驚厥作用，從而提供神經(jīng)保護(hù)作用[11-12]。而在心理壓力和LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)下，小膠質(zhì)細(xì)胞中犬尿氨酸途徑中神經(jīng)毒性分支的KMO、3-HAO 過度激活，生成3-HK 和QUIN，其中QUIN 具有神經(jīng)毒性的作用[13-16]。

慢性不可預(yù)知性應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)的方法是目前被國內(nèi)外研究人員廣泛認(rèn)可的抑郁癥模型復(fù)制方法。本次實(shí)驗(yàn)中，大鼠在經(jīng)過21 d 的應(yīng)激后，水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)次數(shù)較空白組減少，提示抑郁模型大鼠復(fù)制成功。氟西汀及電針治療可增加慢性應(yīng)激大鼠的水平活動(dòng)和垂直活動(dòng)次數(shù)，證明了氟西汀及電針具有抗抑郁作用。

實(shí)驗(yàn)表明，慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致大鼠海馬區(qū)KYNA的含量降低，QUIN的含量升高，KMO mRNA、3-HAOmRNA 的相對(duì)表達(dá)量升高，而KATmRNA的相對(duì)表達(dá)量降低，提示慢性應(yīng)激可以過度激活犬尿氨酸代謝途徑中的具有神經(jīng)毒性的Trp-NAD+途徑，而具有神經(jīng)保護(hù)作用的Trp-KYNA 途徑則被抑制，說明慢性應(yīng)激誘導(dǎo)大鼠的抑郁行為與大鼠機(jī)體的犬尿氨酸代謝途徑出現(xiàn)紊亂導(dǎo)致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷密切相關(guān)。氟西汀組和電針組大鼠KYNA含量較模型組升高，QUIN 的含量降低，KMO mRNA、3-HAO mRNA相對(duì)表達(dá)量降低，KAT mRNA相對(duì)表達(dá)量升高，說明兩種干預(yù)措施均可改變抑郁大鼠的犬尿氨酸代謝異常。

“百會(huì)”“印堂”兩穴，均為督脈要穴。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：“病變?cè)谀X，首取督脈”，“百會(huì)”“印堂”的抗抑郁作用也被多數(shù)學(xué)者驗(yàn)證[17]。本次研究結(jié)果表明，電針“印堂”“百會(huì)”在緩解抑郁的同時(shí)也對(duì)抑郁模型大鼠的犬尿氨酸代謝紊亂產(chǎn)生一定的作用，這可能也是其發(fā)揮抗抑郁作用的一個(gè)機(jī)制。可以說，抑郁與犬尿氨酸通路異常存在著密切關(guān)聯(lián)。電針可以緩解抑郁，改變?nèi)虬彼嵬樊惓?，且?duì)機(jī)體無明顯不良作用，安全有效，值得在臨床進(jìn)一步推廣。

本研究顯示抑郁模型大鼠海馬區(qū)犬尿氨酸相關(guān)代謝產(chǎn)物KYNA、QUIN、KMO、3-HAO、KAT 的變化，說明抑郁狀態(tài)下大鼠的犬尿氨酸途徑異常，進(jìn)而可能導(dǎo)致海馬神經(jīng)損害，電針及氟西汀通過改善犬尿氨酸代謝異常以緩解海馬區(qū)神經(jīng)損害。但本次研究中未直接檢測大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及相關(guān)指標(biāo)變化，不能強(qiáng)有力地證明犬尿氨酸代謝異常對(duì)抑郁模型大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的影響。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，仍需完善相關(guān)數(shù)據(jù)，以深入明確電針抗抑郁的機(jī)制。