廣西東山豬的冷凍精液制作要點

文│鄧祝新 魏莎 黃麗云 梁志敏 李美珍 李芳芳 王英群 韋慧華 肖麗華 覃孝杰（廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站）

廣西壯族自治區(qū)畜禽品種改良站于2019年11月11日啟動了《廣西地方家畜品種遺傳材料采集與保存》項目工作。全州東山豬遺傳材料的采集工作進展順利，同時結(jié)合東山豬的公豬精液特點，在東山豬冷凍精液制作方面取得了一定的經(jīng)驗與效果。

一、公豬精液采集

采精前的準備：集精杯、消毒過濾紗布、一次性消毒手套、毛巾、0.01%高錳酸鉀溶液。

采集方法：引導(dǎo)公豬進入采精室，待公豬爬跨時，用毛巾浸泡高錳酸鉀水后擦干凈公豬下陰部，盡可減少外來污染源。戴上手套，采用手握法采集精液，將紗布蓋在集精杯口，收集豬精時，正好起到過濾豬精內(nèi)膠狀物和雜質(zhì)的目的，通常我們只收集公豬精液濃度最高的中間段，不要采精初段的精清。

二、精液的配液與稀釋

根據(jù)國家對遺傳材料采集相關(guān)工作的要求和標準，公豬精液的配液包含以下幾項工作：

1.原精稀釋液配制。48.5克AndroproPlus＋1升水（32～37℃）混勻，穩(wěn)定1小時。

2.冷卻營養(yǎng)稀釋液（A液）的配制。44克AndrohepCryGaurd＋400毫升水（37℃）＋100毫升雞蛋黃，攪拌均勻，冷卻至17℃。

3.凍凝稀釋液（B液）的配制。40.7克AndrohepCryGaurd＋400毫升水（37℃）＋100毫升雞蛋黃，攪拌均勻，加入37.7克甘油（30毫升丙三醇），混勻。再加入5毫升EquexSTM膏，混勻后至4℃冰箱內(nèi)存放。

4.解凍稀釋液配制。50克AndrohepCryGaurd－Thaw＋1升水（26℃），混勻，穩(wěn)定1小時。

5.稀釋步驟。使用的物品：原精稀釋液、冷卻營養(yǎng)液、凍凝稀釋液、解凍稀釋液、高速低溫離心機、密度儀等。準備：離心管、離心機預(yù)冷、冷卻營養(yǎng)液、密度儀、兩個盆。

精液采集后，用原精稀釋液進行第一次等溫稀釋，稀釋后移入17℃的恒溫冰箱中平衡30分鐘。（搖勻分裝到離心管測密度、看活力、配平、離心、棄液、稀釋、混勻）。

采集到的新鮮豬精液肉眼觀察無異樣后做好采精信息登記。將稀釋液的溫度與新鮮豬精的溫度配平，并且常以1∶3稀釋后放置于隔熱泡沫箱中，裝蓋嚴實。及時送達實驗室進行鏡檢分析。同時將實驗室的工作環(huán)境溫度調(diào)節(jié)在23～25℃。使用移液槍取10微升鮮精，在電子顯微鏡下觀察，綜合評定精子活力，通常情況下，活力在0.65以上、無黏連、無雜質(zhì)的精液可以制作凍精。首先測量每頭公豬精液的密度、活力及精液總量，利用公式計算出每頭豬精需要加入的A液、B液的量。并且做好詳細記錄，將數(shù)據(jù)輸入電子表格待用。將2.4毫升生理鹽水注入比色皿中，再取100微升的新鮮豬精液注入混合、搖勻，用豬精密度儀測試密度。

再將每頭豬的精液均勻分裝到45毫升專用離心管中，擰緊蓋子，做好每管豬精的編號記錄，確保精液不混淆，放到高速離心機中進行離心。離心機內(nèi)的工作溫度是6～8℃、離心轉(zhuǎn)速2500轉(zhuǎn)/分鐘、15分鐘/批。待鮮精離心結(jié)束后將離心管全部取出，把每個離心管的上清液倒掉，剩下最后沉底的精子團，再用100微升移液槍將多余的上清液去掉。然后按照之前的計算量先加A液，搖勻，然后用移液槍吸取全部精液，最后逐一分類、歸攏。

三、豬精的平衡與分裝

將每管已經(jīng)加了A液的豬精和B液一起在17℃的水溫中水浴。轉(zhuǎn)移到4℃的實驗室專用恒溫冰箱內(nèi)靜置3～4小時。此時實驗室的工作溫度要求在18～23℃為宜。經(jīng)過3～4小時的靜置平衡后，將A液和B液取出，轉(zhuǎn)移到4℃條件下的平衡操作柜中進行等溫加液。對照精液記錄信息，按提示量相應(yīng)地加入B液?；旌暇鶆蚝罅⒓催M行精液分裝工作。采用0.25毫升容量的細管，使用法國卡蘇公司生產(chǎn)的IS4全自動精液灌裝一體機和多米諾A系列噴碼機，聯(lián)合灌裝成產(chǎn)品。制作要求：每支細管0.25毫升精液，有效精液量為0.18～0.23毫升的為合格產(chǎn)品。每支細管總精子數(shù)是1億，有效精子數(shù)是2500萬。將分裝好的細管精液排好，放到專用架子上，記錄支數(shù)。再把細管精液放置到4℃的恒溫柜中靜置5～10分鐘。

四、豬精的冷凍制作

打開法國IMV冷凍儀設(shè)備，選擇豬精冷凍程序，啟動冷凍儀。開啟液氮閥門，檢查液氮壓力。當冷凍程序提示冷凍柜達到4℃時迅速打開冷凍柜門，將平衡好的細管精液放入冷凍柜的相應(yīng)架子上，關(guān)門稍等1分鐘，待冷凍柜內(nèi)部溫度穩(wěn)定后點擊開始制凍。約7分鐘后即可完成冷凍過程。從冷凍柜內(nèi)取出細管精液，迅速浸泡到液氮中，這時產(chǎn)品制作完成。

五、豬冷凍精液的解凍與活率觀察

將恒溫水浴鍋調(diào)節(jié)至39℃，另外插入一支水銀溫度計測量實際溫度。將指型管排成一排放置于架子上，浸泡到水浴鍋中。每支指型管分別加入1～2毫升的豬凍精解凍液，待用。從液氮中取出一支冷凍精液，在空氣中晃動1秒，然后迅速、完全浸泡到水浴鍋中，搖晃解凍30秒以上。取出解凍后的凍精，用紙巾擦干表面水分，將細管封口端剪掉1厘米，把整支細管的精液全部擠到指型管內(nèi)，搖勻。用移液槍取10微升，滴注于載玻片上，蓋上蓋玻片，置于電子顯微鏡恒溫板上觀察，要求觀察不同的視野，綜合評定解凍后的精子活力，活率在0.35以上的為合格產(chǎn)品。

六、小結(jié)

為了制作出質(zhì)量好的豬凍精，主要注意以下幾點：

1.精液采集過程中必須要做到消毒、衛(wèi)生，防止異物和雜質(zhì)混入精液中。在采精杯杯口裝上精液過濾紙。

2.采精過程中根據(jù)公豬射精特點，不要前段精清部分，只要中段射精濃的部分，后段排空不要，保證精液濃度符合制作凍精的標準。

3.豬精采集結(jié)束后，要求在等溫情況下盡快把豬精與原精稀釋液混合均勻，然后放置于保溫箱內(nèi)保存，并盡快送到實驗室，防止豬精環(huán)境溫度變化過大，影響活力。

4.豬精平衡后加B液，必須要在4℃的恒溫平衡柜內(nèi)操作，此時實驗室環(huán)境溫度控制在18～23℃，讓豬精在加液和分裝過程中始終保持在低溫環(huán)境下，減少溫差變化對精子的影響。

5.盡管全州東山豬的精液比較耐凍，解凍后成活率高，但想獲得質(zhì)量更好、濃度更高的原精，必須每天給公豬增加蛋白營養(yǎng)，如精飼料、雞蛋等。建議公豬每隔3～4天采精1次為宜。切勿頻繁，造成公豬機能損傷。

6.公豬精液從采集出來、稀釋、加液、平衡，再到進入冷凍階段，始終保持逐級降溫的方式，防止回溫。只有這樣才能制作出優(yōu)質(zhì)的豬凍精。

7.東山豬凍精的最佳解凍溫度是39～39.5℃。將解凍后的整支精液完全擠入解凍液中混勻，取10微升精液，在鏡檢觀察后綜合評定打分。如果取精液量太多，會出現(xiàn)精子堆集、分層、密度過大等問題，不利于判斷精子活率和解凍效果。