外泌體在惡性胸腔積液中的作用及臨床意義

張璐璐 馮小紅 劉冬梅 薛慶亮

惡性胸腔積液(Malignant pleural effusion, MPE)是胸膜腔積聚大量的滲出液，并伴有惡性細胞或腫瘤組織的存在，是轉(zhuǎn)移性疾病的常見并發(fā)癥，可發(fā)生在15%的癌癥患者中。據(jù)統(tǒng)計，在美國每年約有15萬例新發(fā)MPE病例，歐洲每年約有10萬例[1]。MPE的發(fā)病機制較復雜，除與血管生成、血管通透性升高、淋巴管阻塞有關(guān)外，免疫反應、腫瘤微環(huán)境也與MPE的形成有關(guān)。外泌體是一種具有雙層脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的囊泡，在體內(nèi)分布廣泛，幾乎所有的細胞均可產(chǎn)生。其內(nèi)含有的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等物質(zhì)是細胞間信息交流與物質(zhì)交換的重要載體。外泌體在免疫應答、血管生成、腫瘤微環(huán)境等過程中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。隨著MPE的研究進展發(fā)現(xiàn)，外泌體在MPE的生成、鑒別中發(fā)揮重要作用，因此本文就外泌體在MPE中的作用進行闡述。以更好的挖掘外泌體在MPE中的作用，為MPE的診治提供幫助。

外泌體的生物學特征及功能

一、外泌體的生物特征

外泌體是一種直徑約40～160nm(平均約100nm)，由脂質(zhì)雙層膜包圍的細胞外囊泡的一個子集，并由大多數(shù)真核細胞分泌[2]。其內(nèi)含有核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)包括：膜轉(zhuǎn)運和融合相關(guān)蛋白、四跨膜蛋白超家族、多囊體相關(guān)蛋白及其他蛋白質(zhì)[3]。脂質(zhì)包括：磷脂酰膽堿、膽固醇酯、三酰甘油和心磷脂等[4]。核酸包括:長非編碼RNA(Long non-codingRNA,lncRNA)、微小RNA(MicroRNA,miRNA)、環(huán)狀RNA(Circular RNA,CircRNA)、mRNA、DNA等[5]。這些物質(zhì)不僅反映外泌體的來源細胞，也可以作用于目標細胞產(chǎn)生相應的生物學功能，是健康和疾病中細胞間近距離和遠距離通訊的媒介，影響細胞生物學的各個方面。

外泌體起源于內(nèi)吞途徑[6]。其產(chǎn)生過程包括質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷和包含腔內(nèi)小泡(intraluminal vesicles，ILVs)的細胞內(nèi)多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成，以及ILV通過MVB與質(zhì)膜的融合和胞吞作用，最終以外泌體的形式分泌。外泌體的形成與分泌與多種蛋白有關(guān)：包括Rab GTPases、ESCRT蛋白，以及CD9、CD81、CD63等[7]，其中RAB家族，特別是RAB27A、RAB27B、RAB11、RAB35和RAB7在調(diào)節(jié)外泌體分泌中發(fā)揮重要作用。

二、外泌體生物學功能

外泌體具有多種生物學功能，它們的作用與產(chǎn)生細胞的細胞類型密切相關(guān)。其中腫瘤細胞來源的外泌體(Tumor-derived exosomes，TEX)可以參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、促進血管生成和腫瘤細胞的遷移、免疫反應等，因此被認為是癌癥發(fā)展的多方面調(diào)節(jié)因子[8-9]。此外，TEX也是腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment，TME)的重要組成部分[10]。它們在癌細胞和TME之間充當有效的信號分子。

2 促血管生成作用 研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)的非編碼RNA(Non-coding RNA,ncRNA)，特別是LncRNA和miRNA在血管生成的調(diào)控中起著重要作用[14]。此外，在膠質(zhì)母細胞瘤細胞的外泌體中發(fā)現(xiàn)了多種促血管生成蛋白：Ang、VEGF、FGF、IL-6、IL-8和TIMP-1、TIMP-2[15]等。

3 腫瘤微環(huán)境 外泌體是TME的重要組成部分[10]。它們在癌細胞和構(gòu)成TME的周圍細胞之間充當有效的信號分子[16]，如：癌相關(guān)成纖維細胞源性外泌體可以通過抑制線粒體氧化磷酸化促進癌細胞生長[17]。人脂肪干細胞源性外泌體可以通過釋放miR-503-3p調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的增殖和自我更新進而來抑制腫瘤生長[18]。

外泌體與MPE的關(guān)系

一、干擾免疫反應

二、促進血管生成

外泌體富含多種促血管生成物質(zhì)，其中非編碼RNA在血管生成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Tamiya等人收集肺腺癌及其他疾病患者的胸腔積液樣本和匹配的血清樣本，用聚合酶鏈反應分析標本中的RNA序列，發(fā)現(xiàn)腺癌相關(guān)性胸腔積液中外泌體分泌的miR-182和miR-210高于非腫瘤性胸腔積液[22]，而miR-210是一種促血管生成的microRNA，可通過癌癥相關(guān)成纖維細胞(CAF)依賴性機制促進血管生成[23]。此外，Ang-1、Ang-2、MMP、VEGF等多種促血管生成蛋白，已被證明在MPE中發(fā)揮重要作用，同時又在外泌體內(nèi)顯示。隨著研究的進展發(fā)現(xiàn)，癌細胞釋放的外泌體可以改變不同類型的基質(zhì)細胞，促進癌細胞生長和侵襲行為，激活內(nèi)皮細胞自分泌的VEGF信號，促進腫瘤血管生成[24]。因此，外泌體可能通過直接或間接的促血管生成作用來促進MPE的形成。

三、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境

TME由細胞外基質(zhì)、基質(zhì)細胞和免疫細胞等組成[25]。研究表明，腫瘤細胞可以通過釋放外泌體與周圍微環(huán)境進行溝通，促進腫瘤的發(fā)展[15]。此外，MPE中，外泌體已被證實能夠營造腫瘤轉(zhuǎn)移前的微環(huán)境。Watabe等人通過對肺腺癌和肺腺癌胸膜灌洗液外泌體miRNA-21分析檢測發(fā)現(xiàn)，肺泡灌洗液中外泌體miRNA-21可通過誘導間皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化而在胸膜腔內(nèi)形成轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[26]。

外泌體在MPE診療中的應用前景

MPE的治療方法雖然有很多，但大多都是姑息性治療，主要目的是緩解患者癥狀，研究發(fā)現(xiàn)腔內(nèi)用藥可以提高MPE控制率，減少胸腔侵入性操作，改善患者預后，但存在一定的局限性及不良反應，且其控制情況不佳。MPE的診斷金標準是胸膜活檢，但其敏感性低于胸水細胞學檢查。細胞學診斷率接近60%，并且不同腫瘤類型的細胞學檢查的敏感性不同，可能與胸腔積液中惡性細胞較少有關(guān)[27]。因此，目前迫切需要尋找MPE的診療方法。幾乎所有的細胞都可以產(chǎn)生外泌體，包括腫瘤細胞，且外泌體內(nèi)攜帶核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，可以反應其細胞來源，因此，胸腔積液中的外泌體具有成為診斷不同腫瘤源性胸腔積液的特異性生物標志物的潛能。外泌體參與MPE的發(fā)生發(fā)展，其可以作為MPE治療的切入點，為MPE的治療提供新思路。

一、外泌體在MPE中的診斷作用

由于外泌體在各種體液中的存在，以及miRNA在外泌體中的穩(wěn)定性[28]，外泌體miRNA已成為一些癌癥診斷的新的生物標志物。且一些研究已證實外泌體miRNA在MPE診斷的作用。Tamiya等人通過實驗發(fā)現(xiàn)miR-182和miR-210在肺腺癌合并MPE中的表達水平明顯高于良性胸腔積液，推測胸腔積液外泌體中的miR-182和miR-210可以作為區(qū)分肺腺癌合并MPE和良性胸腔積液新的診斷工具[22]。但Han等人通過實驗發(fā)現(xiàn)miRNA-198在肺腺癌相關(guān)MPE中的表達顯著低于良性胸腔積液，將其與腫瘤標志物癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)和細胞角蛋白19片段抗原21-1(Cytokeratin19 fragment antigen 21-1，CYFRA 21-1)相比，發(fā)現(xiàn)miRNA-198的診斷性能與CEA相當，而優(yōu)于CYFRA 21-1，且CEA、CYFRA21-1和miRNA-198三種標志物組成的檢測組合診斷效能最佳。然而，miR-198單獨或全部三種標記物的診斷性能并不優(yōu)于CEA和cyfra21-1聯(lián)合檢測[29]。因此，需進一步研究外泌體miRNA在MPE中的診斷潛能。

二、外泌體在MPE治療中的作用

外泌體在腫瘤微環(huán)境中，由腫瘤細胞和多個間質(zhì)細胞分泌。它可通過其內(nèi)的多種生物分子，參與調(diào)節(jié)多種病理生理過程。研究表明外泌體可以利用其內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)通過促進抗細胞凋亡途徑、藥物外流或藥物隔離、信號轉(zhuǎn)導改變、免疫細胞調(diào)節(jié)等途徑來影響治療的耐藥性[30]。MPE中含有的大量外泌體在其內(nèi)有多種作用，因此，MPE治療效果不佳，可能與外泌體有關(guān)。目前已有研究證實替比法尼、奈替康唑、攀緣唑、酮康唑和三羥甲基酚為外泌體的有效的抑制劑，可以減少腫瘤患者的外泌體數(shù)量[31]。因此，是否可以利用這些藥物減少或清除MPE中的外泌體，也可能是改善MPE的治療效果的一種新的治療方法。

外泌體作為一種天然的納米顆粒生物載體，具有穩(wěn)定、透膜、甚至可以穿透血腦屏障的特點。由于外泌體“識別”特定細胞，因此與脂質(zhì)體等其他生物載體相比，外泌體給藥具有更好的療效和更少的靶向效應[12]。且與自由藥物相比，外泌體的給藥途徑可以大大減少副作用，目前外泌體利用其天然的傳遞能力，已成功地作為藥物和功能性RNA載體用于癌癥治療[3]。此外，通過在外泌體的外表面上顯示靶向分子，例如，識別靶抗原的肽或抗體片段，可以獲得靶向外泌體[32]。因此可以利用外泌體的天然載體特性及靶向功能，為MPE腔內(nèi)給藥提供載體，來提高腔內(nèi)用藥的療效，并降低藥物副作用。

研究表明，由于外泌體可以誘導腫瘤特異性免疫，其作為潛在的腫瘤疫苗引起了廣泛的關(guān)注，并且已經(jīng)進行了動物和臨床試驗來驗證其療效，如DC疫苗[24]。因此，外泌體的抗癌疫苗特性，也可能為MPE的治療提供一條新的治療途徑。隨著研究發(fā)現(xiàn)，外泌體與患者的生存預后也存在一點關(guān)系。通過實驗發(fā)現(xiàn)，滲出液中與外泌體相關(guān)的miRNA表達譜與卵巢癌的預后之間存在相關(guān)性，miRNA-21高表達與患者總生存率降低有關(guān)[33]。因此外泌體可能在MPE的治療和預后中發(fā)揮一定的作用，但需要進一步詳細的研究。

展 望

外泌體具有多種生物學效應，其通過多種機制參與MPE的形成，并且外泌體具有細胞特異性，可以通過其內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)來反應它的細胞來源性，因此，具有成為MPE診斷及預后的潛在生物標志物的潛能。同時，外泌體可以通過影響免疫調(diào)節(jié)、裝載藥物等途徑參與腫瘤的治療，而MPE是胸膜原發(fā)腫瘤和其他部位腫瘤轉(zhuǎn)移至胸膜引起的胸腔積液，是惡性腫瘤的常見并發(fā)癥。因此，外泌體可能為MPE的治療提供新的途徑，但還需要通過大量的實驗來探索及驗證。